糖尿病病证结合动物模型研究进程范文

摘要:现代医学研究多借助动物模型了解疾病的发生发展规律及其防治,疾病动物模型的构建也因此取得了长足进步。中医作为我国的传统医学,在考虑疾病本身的同时,更注重病证结合治疗,因此构建病证结合动物模型更匹配中医药实验研究。糖尿病肾病(Diabetickidneydisease,DKD)是糖尿病(Dia-betesmellitus,DM)最常见且最严重的微血管并发症,中医药对其治疗有着较为显著的临床疗效,因此对其基础研究就显得十分必要,构建适合的病证结合动物模型是实验研究的基本手段。对DKD病证结合动物模型进行了综述。

关键词:糖尿病肾病;病证结合动物模型;综述

高达25%~40%的糖尿病(DM)患者合并有糖尿病肾病(DKD),造成了由DKD发展成终末期肾脏疾病的显著风险,并增加了心血管疾病的发病率和死亡率[1]。现阶段,西医治疗DKD多是在合理饮食和运动的基础上,采用控制血糖、降血压、调节脂质代谢紊乱等治疗方法,但疗效不甚明显。中医认为DKD可归属于“消渴”“水肿”“尿浊”“溺毒”等范畴,辨证施治可取得较好临床疗效。疾病动物模型是现代医学实验中不可或缺的研究手段之一,DKD动物模型构建已较为成熟,基于此的中医病证结合动物模型也有所发展,对中医治疗DKD的方药、药理的研究起到了巨大的推动作用。

1DKD疾病动物模型

国内外学者对于DKD动物模型进行了大量的研究,成功构建了许多理想的动物模型。主要分为三大类:一是诱发性DKD模型,通过化学药物(如链脲佐菌素、四氧嘧啶等)诱导、单侧或部分肾切除、高糖高脂饮食等手段建模;二是自发性DKD模型,利用其定向培育而保留下来的某些基因突变,在自然状态下发生DKD,如NOD小鼠、Akita小鼠、db/db小鼠、BB大鼠、OLETF大鼠、GK大鼠等;三是转基因DKD动物模型,在动物原来遗传背景的基础上,通过改变某种基因的表达水平以建立DKD动物模型,如转基因OVE26小鼠、转基因(mRn-2e)27大鼠等[2]。后两类动物模型与人类DKD最为接近,是十分理想的实验对象,但受获取难度大、技术要求高、价格昂贵等因素的影响,应用受到了限制;现阶段,大多数实验选用诱发性模型,尤其是链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的DKD模型被广泛应用。STZ是一种高度选择性胰岛β细胞毒性剂,小鼠、大鼠、猴等动物对其毒性作用敏感,但兔对其不敏感,现多用于小鼠和大鼠T1DM模型的制造,其肾脏损害与人类糖尿病肾病相似[3-4]。常用单次大剂量(小鼠≥200mg/kg,SD大鼠55mg/kg,WKY大鼠60mg/kg,SHR大鼠45mg/kg)或多次小剂量(小鼠50~70mg/kg,大鼠30mg/kg)行腹腔注射,有研究显示多次小剂量给药的方法造模成功率和稳定性更优[4-7]。此外,动物的遗传背景、性别、附加处理方式等,对造模也有较大的影响。多次小剂量STZ诱导小鼠的血糖水平顺序为DBA/2>C57BL/6>MRL/MP>129/SvEv>BALB/c,DBA/2小鼠的蛋白尿亦最明显,而SD大鼠成模可能优于Wistar大鼠;采用雄性鼠造模要优于雌性鼠;空腹鼠的成模率要高于非空腹鼠;而单侧肾切除合并尾静脉注射STZ的高血糖情况不如单纯腹腔注射STZ,但更符合DKD的病理改变,且节省实验时间[8-11]。先通过一段时间的高糖高脂饮食诱导出胰岛素抵抗,再配合小剂量STZ诱发胰岛素分泌障碍,可以制备2型DKD模型;也有在高糖高脂饮食喂养之前或之后,摘除右侧肾脏,造成左肾代偿性肥大,能提高成模率,缩短成膜时间,且更贴近人类临床特点[12-13]。

2DKD病证结合模型

目前DKD病证结合模型多采用疾病造模因素与证候造模因素相叠加的方式,在运用一次大剂量STZ或高糖高脂饮食+小剂量STZ的同时,配合证候动物模型的研究成果进行造模。中医认为DKD的病机总属本虚标实,患者的本虚证以气虚、阴虚、阳虚为主要表现,标实证中以血瘀、痰湿为主要表现[14]。近年来,研究者已经构建和使用了气虚、气阴两虚、阳虚、阴阳两虚、血瘀、气虚血瘀、阳虚血瘀等多个病证结合模型。

2.1气虚DKD动物模型

DKD为以虚为本,尤以气虚最为常见,且始终贯穿于本病的始末。目前报道的气虚证DKD造模方法有如下2种。朱国茹[15]根据内经“饮食自倍,肠胃乃伤”的理论,用饮食失节(饥饿48h,自由饮食2h)、肥甘过度(普通饲料掺以10%猪油)的方法制造脾气虚模型,2周成模,然后再一次性以53mg/kgSTZ制造DM模型。申晓光[16]则先通过高糖高脂饮食+小剂量STZ造模之后,依据“劳则气耗”的理论,将大鼠每天在水温(37±0.5)℃、深45cm水桶中游泳,待下沉时捞出,并喂以高糖高脂饲料喂养,连续14天后造模成功。这两种方法都能较好地复制出气虚证的临床表现,如精神倦怠萎靡、毛色无光泽、大便异常等。但应该注意疲劳游泳试验易致大鼠呼衰,含脂量过高的饮食也会加重肾实质进行性损害,从而增加造模死亡率[17],因此造模时要密切关注动物的情况,采取降低游泳强度、提供有氧环境、搭配普通饮食等方式或可提升造模成功率。

2.2气阴两虚DKD动物模型

气阴两虚是DKD基本病机,病位主要在脾肾,临床上DKD早期即表现出气阴两虚的症状。周雪梅等[18]给予DN模型大鼠灌胃耗气伤阴中药(青皮、枳壳、附子,组成比为6∶6∶5),剂量达5倍成人等效剂量(3.25g/kg/d),同时应用益气养阴中药反证造模成功。高磊[19]连续25天使用甲状腺素片混悬液10mg/kg/d剂量灌胃,模拟甲亢时出现急躁、多汗、神经过敏、震颤、心率加快等类似于阴虚证候表现,再配合疲劳游泳造模。胡爱民等[20]则是在饥饱失常、疲劳游泳的基础上,根据“恐伤肾”“恐则气下”理论,附以惊吓方式进行气阴两虚造模。大鼠一般情况和血浆检测显示,怒恐情志刺激可制作肝肾阴虚证模型[21],且情志造模符合中医七情致病理论,并能排除造模药物干预对后续的中药研究的不利影响,要优于前两种方案。2.3阳虚DKD动物模型DKD病变中期,病情迁延,则阴损及阳。阳虚动物是最早构建的证候动物模型,多采用激素造模。吴朝妍等[22]在大剂量STZ腹腔注射3天后,臀部肌注氢化可的松注射液每只2mL(10mg),连续15天,制作大鼠糖尿病肾阳虚模型,但其死亡率接近20%(9/52)。孙红旭等[23]用高糖高脂饲料喂养,两次小剂量(30mg/kg,间隔3天)腹注1周后,再予以腺嘌呤350mg/kg/d加苦寒中药煎剂(龙胆草、栀子、番泻叶)4mL/kg/d混合灌服,连续2周,该方法操作较为复杂,且死亡率也不低。这两种造模方法导致大鼠死亡,可能与药物的毒副作用引起代谢混乱,加重脏腑衰竭有关,因此还需寻找更合适的造模手段,单独以苦寒伤阳或许能提示动物存活率,且更具中医特色。

2.4阴阳两虚DKD动物模型

阴阳两虚是DKD晚期的主要证型,但相应病证结合模型却鲜有报道。郭学军[24]等在STZ(一次性55mg/kg)腹腔注射制作T1DM模型后,灌服青皮、枳壳、干姜、黄柏复方(配伍比为1∶1∶1∶1),按24g/kg给药。李慧[25]则采用高糖高脂饮食+小剂量STZ制作T2DM模型后,应用防己、黄柏中药颗粒剂(配伍比为1∶1),按16.7g/kg给药,相当于25倍成人用量,运用其性、味的阴阳归属不同,过用损伤机体的阴液和阳气,从而达到造模的目的。两者所制造的模型均出现肾小球肥大、系膜基质扩张、基底膜增厚等肾脏病理改变,以及阴阳两虚的表现,并使用金匮肾气丸进行反证确认。以上两种造模方式,均先给予STZ刺激构建糖尿病模型,再加以中药干预构建证候模型,结果显示较为符合糖尿病肾病阴阳两虚型,造模较成功。

2.5血瘀DKD动物模型

DKD较少表现出单纯的虚证,往往呈现虚实夹杂的状况;血瘀证作为DKD的主要兼证,贯穿了整个病程的始终。王辉等[26]在一次性大剂量STZ造模成功7周后,皮下注射肾上腺素注射液(0.8mL/kg,2次,间隔4h)模拟暴怒时机体状态,在注射间隔期间,大鼠浸入冰水5min模拟寒邪侵袭,建立DKD血瘀模型,模型的全血黏度和血浆黏度均明显升高。也有学者[27-28]发现单纯使用高糖高脂饮食+STZ造模的大鼠,也可出现爪掌、尾静脉的紫暗瘀血,且血脂、血黏度均升高,具备血瘀、痰浊证的特点。高磊[19]则是DN模型制作成功后,采用甲状腺素+力竭性游泳进行造模,水温控制在8℃,通过“寒则收引”产生血瘀,持续14天,气阴两虚血瘀证造模成功。李海霖等[29]使用真空干燥箱模拟高原地区低压、缺氧的特点,每天3.5h;再放入冰箱冷藏室中对大鼠进行寒冷刺激3.5h,共35天;在建立证候模型的同时,腹腔一次性注射50mg/kg的STZ,构建高原阳虚血瘀型DKS大鼠模型。根据导致血瘀的主因不同采取不同的干预方式造模,但基于中医基础理论均采用了寒冷刺激,且STZ两者都选用了,进一步说明了STZ在糖尿病肾病造模中的重要性及应用的广泛性。

3结语

辨证论治是中医学理论体系的主要特点之一,构建符合中医学理论的证候动物模型是中医药实验研究中十分关键的内容。证候动物模型研究始于上世纪60年代,已有50多年的研究历程,现已能够复制百余种证型,覆盖八纲、六淫、情志、脏腑、气血津液、六经、卫气营血辨证等。DKD病证结合模型即是结合疾病动物模型和证候动物模型的造模方法,既拥有其疾病特点,又有符合相应证候特征,保留了病与证的精密关系,有助于更全面、客观地研究中医药防治DKD的作用及其机制。然而,现阶段DKD病证结合模型的研究仍然存在很多问题:证候类别偏少,临床DKD的证候呈现虚实夹杂、复杂多样的特点,现有的模型过于局限;造模方法不统一,相同证型的可采用多种方式造模,且干预药物及其剂量也存在着较大差异;评价指标不标准,实验动物与人的临床表现不尽相同,套用人的证候表现并不完全合适,同时造模后常多种证候交叠出现,难以明确区分。上述问题影响了DKD病证结合模型的代表性和可信度,致使其应用并不广泛,当前大多数中医药防治DKD的研究使用的仍是DKD疾病动物模型。但相信随着相关研究的不断完善,DKD病证结合模型将对中医药防治DKD研究作出更大贡献。

参考文献：

[2]赖洁梅,周玖瑶.糖尿病肾病动物模型的研究进展[J].中药新药与临床药理,2014,27(1):112-115.

[6]闵筱辉,陈其奎,于涛,等.链脲佐菌素诱导建立长期稳定糖尿病小鼠模型的给药方案研究[J].中国医药导报,2013,10(4):7-10.

[7]张琪,刘亚千,陈华.链脲佐菌素诱导的高血糖对大鼠肾、肝及眼睛的影响[J].南方医科大学学报,2014,34(8):1098-1103.

[9]杨亦彬,张翥,苏克亮,等.链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病肾病模型的方法学探讨[J].华西医学,2005,20(2):299-300.

[10]李莉,陈光亮,韩茹,等.多次低剂量链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病模型的方法学研究[J].安徽医药,2012,16(7):888-890.

[11]李敬林,乔文军,郑曙琴,等.两种糖尿病肾病大鼠模型的比较[J].辽宁中医杂志,2003,30(11):877-878.

[12]王丽,于世家.2型糖尿病肾病大鼠模型制备方法的实验研究[J].辽宁中医杂志,2011(8):1675-1677.

[13]宋恩峰,刘晶晶,贾汝汉,等.2型糖尿病肾病大鼠模型制备研究[J].实用医学杂志,2007,23(18):2840-2842.

[14]丁英钧,王世东,王颖辉,等.糖尿病肾病中医证候分布研究[J].北京中医药大学学报,2010,33(10):695-698.

[15]朱国茹.健脾益肾活血中药对糖尿病肾脏保护作用及其机制的实验研究[D].沈阳:辽宁中医学院,2004.

[16]申晓光.补阳还五汤对实验性糖尿病大鼠肾脏ICAM-1、VCAM-1表达的影响[D].石家庄:河北医科大学,2009.

[17]樊少仪,张秀.糖尿病肾病大鼠中医气虚模型的制作及其影响因素[J].广东医学,2016,37(5):644-647.

[18]周雪梅,陈雪功,程立,等.益气养阴方对糖尿病肾病气阴两虚大鼠肾组织Janus激酶/信号转导子和转录激活子通路的影响[J].安徽中医药大学学报,2013,32(1):70-72.

[19]高磊.糖肾康对DN干预作用的实验与临床研究及DN气阴两虚血瘀证动物模型的建立[D].合肥:安徽中医药大学,2015.

[20]胡爱民,晏玲,张利芳,等.2型糖尿病肾病气阴两虚型动物模型的建立及评价[J].中国中医基础医学杂志,2015(10):1251-1253.

[21]樊蔚虹,岳广欣,李素香,等.长期激怒致肝肾阴虚证动物模型研制[J].中国中医基础医学杂志,2001(9):67-69.

[22]吴朝妍,张莹雯.黄芪多糖对肾阳虚型糖尿病大鼠肾组织NF-κB、TGF-β_1的影响[J].武汉大学学报:医学版,2006,27(3):381-384.

[23]孙红旭,马鸿斌,崔庆荣,等.链脲佐菌素加苦寒中药煎剂致糖尿病肾病病证结合大鼠模型的建立[J].中华中医药学刊,2013(11):2496-2498.

[24]郭学军,吴凌,张永斌,等.1型糖尿病阴阳两虚证动物模型的制作与机理研究[J].新中医,2010(2):93-95.

[25]李慧.2型糖尿病阴阳两虚型大鼠模型实验研究[D].沈阳:辽宁中医药大学,2006.

[26]王辉,杨再刚,燕树勋,等.虎杖总蒽醌对糖尿病肾病早期血瘀模型大鼠脂代谢及血液流变性的影响[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(16):155-156.

[27]徐晶,马二卫,白璐,等.糖尿病肾病大鼠模型瘀血阻络证的确认[J].中国中西医结合肾病杂志,2014,15(1):12-15.

[28]郑学民,林毅,乔文军,等.糖尿病大鼠早期肾病模型的实验研究[J].中国比较医学杂志,2002,12(5):288-291.

[29]李海霖,马春花,贾守宁.高原阳虚血瘀证糖尿病肾病大鼠疾病模型建立的研究[J].高原医学杂志,2013,23(2):22-26.

作者：文雪1；马跃荣2单位：1.成都中医药大学2.成都中医药大学附属医院/四川省中医院病理科