细胞增殖论文范文
细胞增殖论文范文第1篇
【关键词】骨髓内皮细胞GMCSF细胞增殖
EffectsofGranulocyteMacrophageColonyStimulatingFactoronGrowthofMurineBoneMarrowEndothelialCells
AbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatetheeffectsofgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor(GMCSF)onthegrowthofmousebonemarrowendothelialcells.Endothelialcellculturemedium（EndoM）wasusedtoculturemurinebonemarrowendothelialcells.EndothelialcellcolonieswerecountedundermicroscopebyWrightGiemsastaining.TheeffectofdifferentconcentriationofGMCSFontheproliferationofbonemarrowendothelialcellswasobservedbytheformationofendothelialcellcolonies,MTTandflowcytometry.TheresultsindicatedthattheendothelialspecificmarkervWFwasexpressedbythecolonycells,GMCSFpromotedtheproliferationofbonemarrowendothelialcellcoloniesandMTTconfirmedtheeffectofGMCSFonpromotingtheproliferationofbonemarrowendothelialcells.TheresultofdetectingcellcycleshowedthattherateofcellsenteringintoSphasewas9.3%inGMCSFaddedgroupandtherateofcellsenteringintoSphasewas2.1%incontrol.Therewasnosignificantdifferenceincellgrowthcurvebetweenthefirstpassageandfourthpassage.ItisconcludedthatGMCSFcanpromotetheproliferationofbonemarrowendothelialcells,theproliferationpotentialofbonemarrowendothelialcellsbetweenthefirstandfourthpassagenosignificantlychanges.
Keywordsbonemarrowendothelialcells;GMCSF;proliferation
JExpHematol2007;15(3):622-625
目前，已有许多报道证明内皮细胞（endothelialcells,EC）、内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPC）可以用来治疗缺血性心脏病以及各种疾病引起的肢体缺血［1,2］也可以用于组织工程的血管构建［3］，并取得了一定的成果。Kawamoto等［4］报道，EPC对缺血心脏病进行治疗具有良好的效果，一方面减少了缺血组织的面积，同时改善了心脏的功能。Kalka等［5］则报道了利用EPC对肢体缺血的小鼠模型进行治疗，实验结果表明了EPC能显著增加缺血肢体的灌流，而且组织学检查发现缺血部位毛细血管的数目也大大增加。内皮细胞的来源有多种，可以从外周血、脐血及骨髓中获得［6］，而外周血中的内皮祖细胞来源于骨髓。从病人自体的骨髓中获得内皮细胞，一方面来源比较方便，而且也可以避免GVHD的发生。但是由于骨髓基质细胞种类多，难以分离纯化骨髓内皮细胞或内皮祖细胞。本研究用本实验室配制的内皮细胞培养液（EndoM）体外培养小鼠骨髓细胞，分离纯化骨髓内皮细胞及内皮祖细胞，并观察粒巨噬系集落刺激因子（rmGMCSF）对小鼠骨髓内皮细胞体外增殖的影响以及体外增殖后内皮细胞增殖机能的改变，这对临床运用内皮细胞或内皮祖细胞治疗疾病有一定的指导意义。
动物
昆明小鼠，由中南大学湘雅医学院动物学部提供，雌雄不限，普通饮食。
主要试剂和仪器
IMDM为Gibco公司产品；新生牛血清购自杭州四季清生物制品研究所；重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子（rmGMCSF）为R&D公司产品；vWF抗体、CY3标记的羊抗兔IgG为Sigma公司产品；MTT、二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品；酶标仪为Awarens公司产品；CO2培养箱购自美国Forma。
小鼠骨髓内皮细胞及内皮细胞集落的培养
用颈椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下取出股骨，用IMDM冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，取1×106个小鼠骨髓单个核细胞种入1ml含有15%新生牛血清的EndoM培养体系，置于24孔板中，于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天后,用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按每孔1×104个细胞种入24孔板，每组3孔。于二氧化碳培养箱内培养15天后计数内皮细胞集落数，以≥50个细胞的聚合计为1个集落。
内皮细胞的形态观察及vWF的检测
培养的骨髓内皮细胞集落经WrightGiemsa染色后，显微镜下观察内皮细胞形态。用间接免疫荧光法检测骨髓内皮细胞vWF。将内皮细胞培养于24孔板内放置的盖玻片上，当细胞间没有明显的间隙时，取出盖玻片，用PBS清洗，用4%的多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗3次：2%的正常羊血清封闭4小时，加入vWF抗体，4℃过夜，用PBS洗3次，加入二抗CY3IgG，37℃孵育60分钟,PBS洗3次：置于荧光显微镜下观察。以本室建的小鼠骨髓内皮细胞株［7］为阳性对照，骨髓成纤维细胞为阴性对照。
不同浓度的GMCSF对小鼠骨髓内皮细胞形成集落的影响
取纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于24孔板中，每孔5000个细胞，在基本培养体系（含1%浓度EndoM）的基础上分别加入5、10、25ng/ml的rmGMCSF，对照组不加入GMCSF，每组3孔。置于CO2培养箱培养15天，于倒置显微镜下记数集落数，≥50个细胞的聚合计为1个内皮细胞集落。
GMCSF对内皮细胞增殖影响的MTT法测定
将纯化的小鼠骨髓内皮细胞按5000个/孔培养于96孔板，每孔0.2ml，每组3孔。实验组培养体系中分别加入5、25、100ng/ml的rmGMCSF，对照组内不加。在37℃、5%CO2、饱和湿度下分别培养5天和10天，取出培养板吸去培养液，然后加入无血清的IMDM180μl和20μlMTT溶液，放入培养箱孵育4小时，吸去液体，各孔加入DMSO150μl，振荡10分钟，使结晶充分溶解。选择492nm波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值（OD492）。
生长曲线
纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于96孔板中，每孔5000个细胞，加0.2ml含15%新生牛血清的基本培养液，并加入25ng/ml的rmGMCSF。共种6组，每组3孔，培养5天后，分别于第7、9、11、13、15天用胰酶消化后计数细胞，每次3孔，求平均值，做出生长曲线。按公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第1代内皮细胞生长的倍增时间。
细胞周期的流式细胞术检测
无菌条件下取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2ml培养体系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入两种不同培养体系，对照组加含15%新生牛血清的IMDM，实验组加15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，每组各10孔，置于CO2培养箱培养3天后，用胰酶消化细胞，200×g,离心5分钟，用PBS洗涤细胞2次之后，用300μlPBS重悬细胞，加入冰冷的乙醇（-20℃）约700μl（终浓度为70%），将细胞放于-20℃过夜处理后，用流式细胞仪检测细胞周期。
细胞传代培养
取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2ml体系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入15%新生牛血清的IMDM培养液和100ng/ml的rmGMCSF，促使细胞融合，再按1∶4传代于6孔板中，同样加入15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，等细胞生长至融合，按1∶4传代，加入相同培养体系。按上述方法传4代后，绘制生长曲线，方法同前。公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第4代内皮细胞生长的倍增时间，并与第1代的倍增时间进行比较。
统计学处理
实验数据为3次结果，以mean±SD表示。不同处理组两组间比较采用t检验，应用SPSS软件分析，P<0.05表示有统计学意义。
结果
细胞形态每孔种入小鼠骨髓内皮细胞5000个，对照组加基础培养液,实验组在基础培养液的基础上分别加入rmGMCSF5、10、25ng/ml。与对照组相比，实验组集落数均明显增多（图3），说明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞的增殖有明显刺激作用。
rmGMCSF对内皮细胞增殖的影响
小鼠骨髓内皮细胞培养5、10天，分别进行MTT的检测，结果表明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞生长促进作用明显，各组与对照组相比差异显著（P<0.01）（图4）。
GMCSF对EC细胞周期的影响
运用流式细胞仪检测细胞周期，观察GMCSF对EC细胞周期的影响。结果显示GMCSF使细胞进入S期的比例为9.3%，与对照组2.1%相比有明显差别。此结果说明GMCSF能够促使细胞进入S期，加快细胞的分裂，从而促进了细胞的增殖（图5）。Figure5.EffectofGMCSFoncellcycleofendothelialcells.A:grouptreatedbyGMCSF.B:controlgroup.
体外扩增传代对内皮细胞增殖的影响
图6为小鼠骨髓第1代和第4代内皮细胞的生长曲线。利用计算公式［DT=t×1g2/(1gN-1gN0)］计算出第1、4代细胞生长的倍增时间分别为30.25±0.55小时、31.67±0.26小时。第1代与第4代的细胞倍增时间相比，无明显差异，表明经体外扩增传代4次，仍能保持传代早期的增殖潜能。
Figure6.Growthcurveofthefirstandfourthpassagegenerationsofmurineboneendothelialcells.讨论
国内外对于骨髓内皮细胞的纯化报道较少，但已经进行了一些关于细胞因子对内皮细胞增殖影响的研究，如Yonekura等［8］报道VEGF可以促进内皮细胞的增殖，Rieck等［9］则报道bFGF可促进角膜内皮细胞的生长。我们此前曾报道了VEGF、bFGF、SCF、IL6、GMCSF等对内皮细胞株的增殖有促进作用［10］。GMCSF对未经转化的骨髓内皮细胞增殖的作用尚未见报道。本研究中，我们用本室配制的培养基在较短的时间内纯化了小鼠的骨髓内皮细胞，vWF为阳性，并在此基础上观察了GMCSF对骨髓内皮细胞增殖的影响。应用基本培养基培养内皮细胞集落时，形成的集落数较少，加入rmGMCSF后，集落生成明显增多。MTT的结果亦支持GMCSF对小鼠骨髓内皮细胞生长的刺激作用。细胞生长曲线的结果表明，在含GMCSF培养的条件下，内皮细胞生长的倍增时间为30.25±0.55小时，经4次传代后细胞倍增时间无明显延长，表明体外培养扩增4代后，细胞仍能保持早期的增殖能力，GMCSF对骨髓内皮细胞的体外增殖有明显刺激作用。文献报道内皮细胞表面有GMCSFR的存在，而内皮细胞本身也可以分泌GMCSF［11］。结合细胞周期测定的结果，可以认为，GMCSF促内皮细胞增殖的机制可能是GMCSF与GMCSFR结合，通过细胞内信号传递使更多的细胞进入S期来实现的。
【参考文献】
1LuttunA,CarmelietG,CarmelietP.Vascularprogenitors:frombiologytotreatment.TrendsCardiovascMed,2002;12:88-96
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3ZammarettiP,ZaischAH.Adult‘endothelialprogenitorcells’.Renewingvasculature.IntJBiochemCellBiol,2005;37:493-503
4KalkaC,MasudaH,TakahashiT,etal.Transplantationofexvivoexpandedendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularization.ProcNatlAcadSciUSA,2000;97:3422-3427
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7王绮如，严燕，汪保和.小鼠骨髓内皮细胞系的建立.中国实验血液学杂志，1997；5：360-366
8YonekuraH,SakuraiS,LiuX,etal.PlacentagrowthfactorandvascularendothelialgrowthfactorBandCexpressioninmicrovascularendothelialcellsandpericyts.Implicationinautocrineandparacrineregulationofangiogenesis.JBiolChem,1999;274:35172-35178
9RieckP,OliverL,EngelmannK,etal.Theroleofexogenous/endogenousbasicfibroblastgrowthfactor(FGF2)andtransforminggrowthfactorsbeta(TGFbeta1)onhumancornealendothelialcellsproliferationinvitro.ExpCellRes,1995;220:36-46
细胞增殖论文范文第2篇
论文摘要目的：探讨糖尿病足中医辨证分型与血管细胞核增殖相关抗原的表达差异。方法：对32例截肢的糖尿病足患者按中医辨证分为气血两虚瘀阻证、脉络瘀热证、脉络热毒证和气阴两虚瘀阻证，分别对其截肢肢体的胫后动脉应用免疫组化法对细胞核增殖相关抗原（Ki67）的表达进行观察、分析。结果：Ki67的阳性表达与糖尿病足动脉硬化闭塞程度呈负相关，与血管炎症病变程度呈正相关。结论：炎症在糖尿症的大血管病变的过程中起到了重要的作用。
糠尿病足是糖尿病的严重并发症，据统计1996年全球糖尿病患者1．2亿，预计到2025年，将达到2．5亿以上，而大约15％的糖尿病患者将在其生活的某一时间发生足溃疡或坏疽[1]。目前对于糖尿病足病因及发病机制虽然还不是完全清楚，但大家公认糖尿病合并大血管病变导致动脉粥样硬化是糖尿病足发病的最主要因素。现将2004年10月～2005年5月间我们收治的32例糖尿病足患者的截肢动脉标本的血管细胞核增殖相关抗原(Ki67)与其中医辨证分型的相关性研究情况报告如下。
1临床资料
1．1一般资料：32例均为天津医科大学代谢病医院和天津中医学院第一附属医院2004年10月～2005年5月间的住院患者，其中男性24例，女性8例；年龄50～86岁，平均年龄69．2岁；糖尿病病程最长30年，最短6年，平均18±2．4年。
1．2诊断标准：糖尿病足的诊断标准采用2000年中华医学会糖尿病学会第二届糖尿病足会议所制订的“糖尿病足(肢端坏疽)检查方法及诊断标准”。
1．3截肢标准：参照国际糖尿病足工作组编写的《糖尿病足国际共识》中关于“大截肢的定义、标准和指标”[2]执行。
1．4中医辨证分型标准：参照《中医外科学(第七版)》及《中药新药临床研究指导原则·脱疽》之中医辨证分型方案分为气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证、脉络热毒证四型。
2观察方法
2．1标本取材：坏疽截肢标本32例，其中按中医辨证分型气血两虚瘀阻组10例，脉络瘀热组10例，气阴两虚瘀阻组4例，脉络热毒组8例，取各例标本下肢胫后动脉。标本经过10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，备用。
2．2设备、试剂：美国PENGUIN-600CL自动图像分析系统，细胞核增殖相关抗原(Ki67)抗体PV9000试剂盒DAB购于北京中山生物技术有限公司。
2．3免疫组织化学法：标本常规石蜡包埋，4μm连续切片，采用PV法进行免疫组化染色，染色过程严格按试剂盒染色程序进行，选取已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。观察细胞核增殖相关抗原(Ki67)，阳性物质呈棕黄色细颗粒状于细胞核表达，采用美国PENGUIN-600CL图像分析系统进行图像分析，选取病变处每500个细胞Ki67的阳性表达率作为其阳性表达指数。统计学处理应用SPSS10．0软件包进行方差分析。
3结果
3．1中医各证型所占比例以及年龄、性别分布：各证型比例，气血两虚瘀阻组10例（31．25%），脉络瘀热组10
例（31．25%），气阴两虚瘀阻组4例（12．5%），脉络热毒组8例（25．0%）。年龄、性别分布情况，见表1。
表132例患者年龄、性别分布n（%）
性别n50~60岁61~70岁71~80岁80岁以上男24（75．0）4（12．5）8（25．0）11（34．4）1（3．1）女8（25．0）1（3．1）3（9．3）4（12．5）0总计32（100．0）5（15．6）11（34．4）15（46．9）1（3．1）3．2免疫组织化学法观察各证型Ki67表达差异：具体情况见表2。
表2各证型Ki67阳性表达指数比较（%）
证型Ki67阳性表达指数脉络热毒4．87±1．01*气阴两虚瘀阻1．86±0．47脉络瘀热1．49±0．13气血两虚瘀阻0．30±0．18注：与气血两虚瘀阻型比较，*P<0．05。
气血两虚瘀阻证、脉络热毒证、脉络瘀热证、气阴两虚瘀阻证中均可见部分细胞Ki67呈阳性表达，在脉络热毒证中表达指数最高，气血两虚瘀阻证中表达指数最低，二者比较具有显著性差异(P<0．05)。
4讨论
Ki67抗原为细胞核内与细胞分裂增殖相关的蛋白抗原，分子量为345kd和395kd，其编码基因位于第10号染色体上。Ki67的表达出现于G1中期到晚期，S期和G2期逐渐增加，有丝分裂期达高峰，分裂后迅速降解或丢失抗原决定簇，到G0期则不表达，半衰期为lh或更短[3]。有人认为它可能是具有蛋白结合特性的重要结构，在有丝分裂中起着维持DNA规则结构的重要作用[4]，是一个反映细胞增殖的敏感指标。
在糖尿病足的不同辨证分型中气血两虚瘀阻证、脉络热毒证、脉络瘀热证、气阴两虚瘀阻证中Ki67表达均呈阳性，在脉络热毒证中表达最强、气血两虚瘀阻证中表达最弱，二者相比具有显著性差异(P＜0．05)。根据Ki67阳性指数可以判断细胞增殖的活性，指明细胞增殖与糖尿病足动脉病变的关系。在糖尿病足的不同辨证分型中动脉的硬化闭塞程度由轻到重依次是脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证。Ki67的阳性表达与糖尿病足动脉硬化闭塞程度呈负相关。而在通过对32例糖尿病足截肢的动脉进行病理学观察的过程中发现糖尿病足血管病变主要体现在中动脉的病理学变化，其中脉络热毒、气阴两虚瘀阻两证型以动脉周围及全层的炎症性改变为主；脉络瘀热、气血两虚瘀阻证以中膜钙化、平滑肌细胞萎缩、变性、坏死及胶原纤维增多及内膜粥样斑块形成为主，炎症表现不明显；而Ki67的阳性指数与血管炎症病变程度呈正相关。这说明炎症在糖尿病的大血管病变的过程中起了重要的作用，特别是在脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证两型，这对临床具有重要的指导意义。
5参考文献
1BoultonAJ.Thediabeticfoot：aglobalview.DiabetelMetabResRev，2000，16(1)：2．
2许樟荣，敬华．糖尿病足国际共识．中华糖尿病学会第二届足病第一次足病研讨会．2002，435．
细胞增殖论文范文第3篇
[关键词] 雷帕霉素；乳腺癌；多药耐药；逆转
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）24-11-02
The Initial Exploration about Reverse Effect of Rapamycin on Multidrug Resistance of Human Breast Cancer Cell
SHEN Xiangdi QIU Rong FAN Xingli CHEN Jian LIU Dandan
Zhejiang Medical College， Hangzhou 310053， China
[Abstract] Objective To explore the reverse effect of rapamycin on multidrug resistance of human breast cancer cell MCF-7/ADR. Methods MTT was applied for detecting the proliferation rates of MCF-7 cells and MCF-7/ADR cells which treated by rapamycin （10μM）， ADM （10，50，100，500，1000，5000，20000，40000，100000ng/mL），or rapamycin combined with ADM. Results For the proliferation rate of MCF-7 cells，rapamycin （10μM） did not affect it， ADM （500，1000，5000，20000，40000，100000 ng/mL） reduced it，and combined with rapamycin， the concentration of ADM which could reduce it was greater than or equal to 500 ng/mL. For the proliferation rates of MCF-7/ADR，rapamycin （10μM） did not affect it， ADM （40000，100000ng/mL） reduced it，and combined with rapamycin，the concentration of ADM which could reduce it was greater than or equal to 1000ng/mL. Conclusion Rapamycin could reverse the multidrug resistance of MCF-7 cells.
[Key words] Rapamycin； Breast cancer； Multidrug resistance； Reverse
雷帕霉素是丝氨酸-苏氨酸激酶（mTOR）的特异性抑制剂，可以通过阻滞肿瘤细胞生长周期、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤内血管生成过程等多种机制抑制肿瘤的生长，近来还有研究表明mTOR信号传导通路还与肿瘤的多药耐药有关[1，2]。本研究旨在研究雷帕霉素对乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/ADR的耐药逆转作用。
1 材料与方法
1.1 细胞株
MCF-7细胞系（上海细胞库）；MCF-7/ADR细胞系（南京凯基生物发展有限公司）。
1.2 仪器和设备
酶标仪（Thermo MK3，美国），冷冻离心机（Beckman Coulter-Allegra 64R，德国），细胞培养箱（Heraeus公司，德国），超净工作台（上海博迅医疗设备厂）。
1.3 试剂
雷帕霉素（台州市晟欣医药化工有限公司），盐酸阿霉素（ADR，上海君创生物科技有限公司），MTT（Sigma公司，美国），RPMI1640（杭州吉诺生物医药技术有限公司），小牛血清（杭州四季青生物公司），DMSO（国药集团化学试剂有限公司），胰酶（杭州吉诺生物医药技术有限公司）。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养 MCF-7细胞在5%CO2、37℃条件下，在含10%小牛血清的RPMI1640培养液中常规培养，待细胞长满瓶壁的2/3时，胰酶消化，传代培养。MCF-7/ADR细胞的培养基为含有0.5μmol/L ADR的RPMI1640培养液，在实验前两周停止加入ADR，其余培养方法与MCF-7细胞相同。取对数生长期的MCF-7细胞、MCF-7/ADR细胞分别用胰酶消化，调整细胞的浓度至5×103/mL，每孔100μL，接种于96孔板中。放置于37℃、饱和湿度的5%CO2培养箱24h后备用。
1.4.2 雷帕霉素对MCF-7细胞增殖活性的影响 根据文献用MTT法测定。采用1.4.1的方法准备MCF-7细胞，加药。共分两组，每组设4个复孔。①空白对照组；②雷帕霉素组：雷帕霉素的终浓度是10μM。24h后加入31.5μL的MTT（5mg/mL），培养4h后去除培养液，加入DMSO 200μL，震荡5min后，570nm测定每孔的吸光值（OD）。细胞增殖率＝OD实验组/OD对照组×100%。
1.4.3 雷帕霉素对MCF-7/ADR细胞增殖活性的影响 取1.4.1的方法准备的MCF-7/ADR细胞，采用1.4.2的方法计算出细胞增殖率。
1.4.4 阿霉素对MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞增殖活性的影响 细胞的增殖活性根据1.4.2的方法用MTT法测定，将准备好的MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞分别分组，每组设4个复孔。①空白对照组；②阿霉素组：加入25μL不同浓度的阿霉素，使其终浓度为10、50、100、500、1000、5000、20000、40000、100000ng/mL，药物处理24h后，采用1.4.2的方法计算细胞增殖率。
1.4.5 雷帕霉素和阿霉素对MCF-7细胞增殖活性的影响 细胞的增殖活性根据1.4.2的方法用MTT法测定。取准备好的MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞，分别分组，每组设4个复孔。①空白对照组；②实验组：加入25μL不同浓度的阿霉素，使其终浓度为10、50、100、500、1000、5000、20000、40000、100000ng/mL，再加入终浓度为10μM的雷帕霉素，药物处理24h后，采用1.4.2的方法计算细胞增殖率。
1.5 统计学处理
数据经SPSS14.0软件处理。所有数据均采用平均值±标准差（χ±s）表示，组间均数比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 雷帕霉素对细胞增殖活性的影响
与对照组相比，10μM的雷帕霉素处理过的MCF-7细胞（t=1.30，P＞0.05）与MCF-7/ADR细胞（t=-1.70，P＞0.05）的增殖率均无显著差异。见表1。
2.2 不同浓度阿霉素对细胞增殖活性的影响
与对照组相比，MCF-7细胞经500ng/mL及以上浓度的阿霉素处理，细胞增殖活性有显著差异（P＜0.05）；而MCF-7/ADR细胞在40000ng/mL和100000ng/mL浓度的阿霉素处理下，细胞增殖活性与对照组相比，有显著差异（P＜0.05）。见表2。
2.3 雷帕霉素联合阿霉素对细胞增殖活性的影响
MCF-7细胞中加入500ng/mL及以上浓度阿霉素联合10μM雷帕霉素处理24h以后，细胞增殖率与对照组相比有显著差异（P＜0.05）。而在MCF-7/ADR细胞中加入1000ng/mL及以上浓度阿霉素联合10μM雷帕霉素处理24h以后，细胞增殖率与对照组相比有显著差异（P＜0.05）。见表3。
3 讨论
在本研究中，10μM的雷帕霉素作用于MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞24h，与对照组相比，细胞增殖率没有显著差异，说明这个浓度的雷帕霉素作用细胞24h不会影响细胞增殖的活性，对这两种细胞都没有细胞毒性。同时，我们也检测了不同浓度的阿霉素对两种细胞的增殖活性影响。结果发现，500ng/mL及以上浓度的阿霉素作用于MCF-7细胞24h，细胞的增殖活性与对照组相比有显著差异，说明500ng/mL及以上浓度的阿霉素能降低MCF-7细胞的增殖。而对于MCF-7/ADR细胞，只有40000ng/mL和100000ng/mL的阿霉素处理24h后，细胞的增殖活性明显降低，其他浓度和对照组相比均无显著差异，这是MCF-7/ADR细胞具有耐药性所决定的。本研究的目的是初步探讨雷帕霉素对MCF-7/ADR细胞的多药耐药逆转作用。因此，在做了以上基础工作以后，我们将本身不产生细胞毒作用的10μM的雷帕霉素和不同浓度的阿霉素联合分别作用于MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞。结果发现，500ng/mL及以上浓度的阿霉素可以降低MCF-7细胞的增殖率；而单独阿霉素引起MCF-7细胞增殖率降低的浓度也是590ng/mL。而对于耐药细胞系MCF-7/ADR，与雷帕霉素联合后，1000ng/mL及以上浓度阿霉素可引起细胞增殖率的降低，抑制细胞的增殖；而单独用阿霉素，需要40000ng/mL及以上浓度才能抑制细胞的增殖。前述实验证明该浓度的雷帕霉素对细胞无直接毒性，说明加入雷帕霉素后，MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性增高。由本实验结果可以推论雷帕霉素能逆转MCF-7/ADR细胞的耐药性。
在以往的研究中，膀胱癌多药耐药细胞系和B淋巴细胞多药耐药细胞系经雷帕霉素作用后，其多药耐药性均有所逆转[2，3]。而本实验也表明，在乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/ADR中，雷帕霉素也有此作用。多药耐药的逆转涉及多种机制，雷帕霉素对于乳腺癌细胞的作用机制具体是什么，还需要进一步研究。
[参考文献]
[1] Zoncu R，Efeyan A，Sabatini DM. mTOR： from growth signal integration to cancer， diabetes and ageing[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2011，12（1）：21-35.
[2] Grünwald V，DeGraffenried L，Russel D，et al. Inhibitors of mTOR reverse doxorubicin resistance conferred by PTEN status in prostate cancer cells[J]. Cancer Res，2002，62（21）：6141-6145.
细胞增殖论文范文第4篇
关键词：细胞因子，生长因子，脑膜瘤
脑膜瘤是颅内仅次于胶质瘤的常见原发肿瘤，占脑肿瘤的10%～15%，几百年来，一直受外科医师的关注，其主要以手术治疗，但辅助治疗也极为重要[1,2]。科技论文，脑膜瘤。细胞因子和生长因子通过脑膜瘤的自分泌和旁分泌效应产生，而这些因子经过与脑膜瘤上特异受体相结合，调控脑膜瘤的增殖[3,4]。这些因子的研究为脑膜瘤的辅助治疗提供了新途径。
一、生长因子及其作用
1、血管内皮生长因子（vascular endotheliargrowth factor,VEGF）又称血管通透因子（vascular permenbility factor,VPF），是1989年由Fferrare等从牛垂体的滤泡星状细胞中提取的1种糖蛋白，是1种高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂原，可通过与VEGF受体(VEGFR)特异性结合，从而刺激血管内皮细胞增殖和血管通透性增加，促进新生血管生成，在脑膜瘤的生长和转移中发挥重要作用。其家族有6个成员：VEGF-A（通常所指的VEGF）,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E以及胎盘生长因子[5],均为同源二聚体蛋白，且具有相似的空间结构，分别定位于不同的染色体。目前已发现的VEGF受体（vascular endotheliargrowth factor receptor,VEGFR）有5种，其中有3种属于酪氨酸蛋白激酶受体超家族，VEGF-1（Flt-1）、VEGFR-2(KDR/FIk-1)、VEGFR-3(FLt-4)，不同受体具有各自特异的生物学特性。VEGF主要通过VEGF-1和VEGFR-2在内皮细胞上发挥作用[6]。VEGFR-2在体内外触发细胞内信号转导机制中均发挥作用，为发挥作用的主导受体，可与所有形式的VEGF相互作用[7],其为诱导内皮细胞增殖和分化的主要介质，与VEGFR-1共同完成血管的新生。VEGFR-1能以可溶形式存在，因为对VEGF而言它的胞外部分比VEGFR-2更具有亲和力[8]。VEGF的另外两种受体是Npn-1 和Npn-2，它们是1种非酪氨酸激酶跨膜蛋白，细胞内部分比较短，不能介导Semaphorin的信号转导。Merrill等[9]报到在正常大脑组织中可检测到低水平的VEGF表达，但意义并不清楚。谢尚闹等[10]用免疫组化方法检测，发现正常脑膜组织不表达VEGF，而脑膜瘤中均有不同程度的VEGF蛋白表达。科技论文，脑膜瘤。
2、血小板源生长因子（PDGF）: PDGF家族包括PDGF-AA和PDGF-BB及其相应受体包括PDGF-α-R和PDGF-β-R。除PDGF-α-R外，其余成员的mRNA均在脑膜瘤细胞中检出，且在绝大多数脑膜瘤培养上清液中发现PDGF-AA和PDGF-BB。PDGF可刺激脑膜瘤细胞的增殖，外加PDGF（主要是PDGF-BB）以剂量依赖关系促进培养脑膜瘤细胞增殖，且PDGF抗体可显著抑制脑膜瘤培养液提取液所刺激脑膜瘤细胞的增殖[11]。徐广明等[12]研究揭示了PDGF在脑膜瘤生长于发生过程中的作用，表明PDGFB链可以作为反义基因治疗脑膜瘤的优选靶向。
3、成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowth factor,FGF）:由垂体和下丘脑分泌的多肽，可以促进细胞，特别是内皮细胞增殖的蛋白因子家族，在细胞的生长、分化中起关键作用，与血管的生成，伤口的愈合和胚胎发育有关，对某些祖细胞的分化具有抑制作用。FGF及其相应受体皆在脑膜瘤细胞中表达，且FGF亦以剂量依赖关系促使无血清培养液中脑膜瘤细胞的增殖，故认为FGF参与脑膜瘤细胞自分泌生长刺激环路[13]。姚曙光等[14]研究显示，FGF-1和FGFR-1在正常脑组织和脑膜瘤组织中均有表达，并且在高病理级别组的表达显著强于低病理级别祖，二者与脑膜瘤病理分级密切相关。这提示FGF-1的促有丝分裂活性可能对脑膜瘤细胞的增殖有重要作用。科技论文，脑膜瘤。
4、胰岛素样生长因子（insulin-like growthfactor,IGF）: IGF包括IGF-I和IGF-II，它们及其相应的受体的mRNA均在脑膜瘤细胞中表达，并在培养的脑膜瘤内检到IGF-I和IGF-II。在正常对照的脑膜瘤中IGF-I及其受体mRNA的存在，这提示IGF-II可能是主要的脑膜瘤生长调控因子。另外。IGF亦以剂量依赖关系刺激脑膜瘤细胞DNA的合成[15]。所以IGF确系脑膜瘤自分泌刺激因子。
5、其他生长因子：表皮生长因子及其受体，脑膜瘤细胞及其微粒体中含有EGF受体，但EGF在脑膜瘤细胞培养上清中仍未检出，故推测其可能以旁分泌方式参与脑膜瘤增殖调控[4].此外，转化生长因子等亦可能参与脑膜瘤的调控。
二、细胞因子及其作用
1、白细胞介素（IL）既往认为IL是淋巴细胞产生的细胞因子，但目前发现很多肿瘤细胞均可分泌IL，其中确定与脑膜瘤有关的IL有以下两种类型。
（1）IL-6:众多实验表明，IL-6为脑膜瘤的自分泌因子。1994年Todo首次在培养细胞中发现IL-6mRNA的存在，并利用放射免疫法在其培养上清中检出IL-6[16]。IL-6可促使急性期蛋白合成，血管形成及多种细胞增殖，但其对脑膜瘤的作用尚有争议。Lichtor等采用生物学活性检测却发现，外加IL-6可显著促使培养的脑膜瘤细胞增殖[17]。IL-6通过与细胞表面相应受体结合后刺激gp130胞内部分酪氨酸磷酸化而发挥作用。在不同的组织与细胞中其表现出不同的生物行为，如对大多数肿瘤细胞，IL-6表现出促进增殖作用；但同时IL-6亦抑制少数其它肿瘤的生长。师蔚等[18]研究认为，与IL-6的多效性生物学行为有关，即IL-6本身可能抑制脑膜瘤细胞的增殖，但当其浓度增高到一定程度是却能诱导其它脑膜瘤促增殖细胞因子或受体的表达，从而总体上因IL-6浓度不同而表现出不同效应；亦可能与IL-6在不同亚型脑膜瘤细胞内具体的信号转导机制不同相关，有待于进一步探讨。
（2）IL-1β：是脑膜瘤自分泌增殖抑制因子，Levy采用ELISA法，定量测出脑膜瘤培养上清液中IL-1β的相对浓度，而在正常对照组则尚未检出[4]。外加IL-1β可显著抑制培养的脑膜瘤细胞的增殖[17]这与IL-1β可诱导NK细胞的杀伤活性，从而具有抗肿瘤作用的观点一致。王贵新等[18]研究认为IL-1β与恶性脑膜瘤的发生有关。
（3）其它类型：IL-3为多重集落刺激因子，可促使多种细胞增殖，IL-3对培养脑膜瘤细胞有明显的促增殖效应，推测该作用系IL-3于脑膜瘤细胞表面相应受体结合所致；IL-8为趋化因子的一种，其对某些肿瘤细胞尚表现出增殖效应，本研究表明IL-8在10ng/ml时对脑膜瘤细胞展示最大促增殖效应，但在其它浓度组却并未表现出显著的促增殖效应，故尚不能肯定IL-8对脑膜瘤细胞增殖的促进作用，因体外实验中对某些因子作用的判断应具有剂量依赖关系[19]。
2、肿瘤坏死因子（tumor necrosisfactor,TNF）最初发现这种物质造成肿瘤组织坏死而得名。科技论文，脑膜瘤。根据其产生来源和结构不同，分为TNF-α和TNF-β两类，前者由单核-巨噬细胞产生，后者由活化的T细胞产生，又名淋巴毒素，两类TNF基本的生物活性相似，除具有杀伤肿瘤外还有免疫调节，参与发热和炎症的发生[20]。王贵新等[18]研究认为TNF-α与恶性脑膜瘤的发生有关。科技论文，脑膜瘤。占世坤等[21]研究脑膜瘤病人术后TNF的表达逐步正常，这与肿瘤切除彻底，瘤周水肿较轻有关。科技论文，脑膜瘤。转移瘤及恶性程度较高的星形细胞瘤患者术后血清中TNF的水平仍持续升高，可以认为TNF可以作为预测肿瘤预后的一项指标，进一步研究肿瘤患者TNF的表达，可以为肿瘤的TNF治疗提供理论参考。
三、相关因子在脑膜瘤治疗中的作用
众多学者提出，既然脑膜瘤处在复杂的自分泌和旁分泌生长调控网络中，那么采取某些措施有效地打断其生长刺激环路，则可能会抑制脑膜瘤的增殖[2,3,4]。
1、相关因子拮抗剂Trapidil：Trapidil以剂量依赖关系抑制大多数正常培养脑膜瘤的增殖，同时因为Trapidil具有拮抗PDGF样因子的作用，对外加脑膜瘤培养提取液所刺激脑膜瘤细胞的增殖仍有抑制作用[22]。相关因子拮抗剂Suramin以剂量依赖关系拮抗上述生长因子与其特异性受体结合，抑制脑膜瘤细胞增殖，而且当浓度达100μmol/L时，可使EGF、IGF-I或PDGGF-BB所刺激脑膜瘤细胞完全破坏[23]。
2、Ca²+通道阻滞剂：在培养的脑膜瘤细胞中，当外加Ca通道阻滞剂Verapamin的浓度达1μmol/L时，则可降低EGF、IGF、PDGGF或FGF所刺激脑膜瘤细胞的增殖，但更高浓度不能使抑制效应更明显[24,25]。
随着分子生物学研究的不断进展，为肿瘤的治疗开辟了一条新的途径，细胞因子与生长因子虽然目前尚未见到在脑膜瘤基因治疗中的应用，但随着脑膜瘤分子生物学特性及其联合基因治疗方案的深入研究，脑膜瘤自旁分泌相关因子定会在其基因治疗中发挥出重要作用。
参考文献
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细胞增殖论文范文第5篇
【关键词】 重组人表皮细胞生长因子；人表皮细胞；增殖
细胞增殖、分化、成熟的调控依赖多种活性蛋白质及多肽，统称为生长因子。目前已发现包括表皮生长因子(epidermal growth factor, egf)在内的多种生长因子。重组人表皮生长因子(recombinant human egf，rhegf)是通过人工合成的表皮生长因子基因片段在大肠杆菌表达系统进行有效表达而获得的可促进多类细胞生长的多肽类物质, 其活性和结构与天然产物高度一致[1]。具有广泛的促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较大的临床应用价值。在制备过程中不同的提取以及纯化方法对多肽的活性影响较大，本文就应用细菌发酵法获得的rhegf对人表皮细胞的增殖作用进行研究。wWw.133229.cOM
1材料及方法
1.1试剂
重组人表皮生长因子，细菌发酵法获得。dmem、prmi1640培养基为美国gibeo产品，小牛血清、胎牛血清为成都哈里生物工程有限公司；mtt为美国sigma产品。
1.2实验方法及结果
1.2.1表皮细胞取材以及培养包皮环切术后标本，pbs洗涤三次，眼科剪剔除多于皮下组织；25%trypsin冷消化过夜，分离表皮与真皮，并去除真皮，制备细胞悬液；1000 rpm×10 min离心，去上清，培养基重新混悬细胞沉淀，用血细胞计数仪计数，并用台盼兰染色，了解细胞存活率。将上述细胞悬液按一定细胞密度接种于培养皿中，置37 ℃，5%co2孵箱中；2天～3天换液一次；当细胞长满瓶皿70～80%时，根据需要传代或冻存细胞。
1.2.2mtt 法测定细胞的增殖取对数生长期细胞1.5×105接种于96 孔培养板内，每孔100 μl，设6 个复孔。加rhegf使浓度为 0,5,10，20,50,100 ng·ml-1及调零孔加100 μl培养液，继续培养48 h，结束前4 h，加10 μl mtt,常规终止实验，与酶联免疫检测仪上测各孔吸光值，波长490 nm。按下列公式计算相对增殖率（relative growth rate, rgr）：rgr = 给药孔吸光度值/对照孔吸光度值×100%。
1.2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达接种2×105个细胞于75ml培养瓶中，待细胞贴壁后加入不同浓度的rhegf作用于细胞48小时，收集细胞，流式细胞仪检测细胞的增殖，根据细胞周期时相，计算细胞的增殖指数（pi）：pi=(s+g2/m) / (g0/g1+s+g2/m)×100% 。基因产物表达含量分析：上机检测前用pbs 洗离心除去固定液，冰冷pbs 洗涤细胞3 次，按免疫组化方法分别加入cmyc, cfos和cjun单抗,使用浓度1∶100，然后加入荧光素标记的二抗igg,37 ℃作用30分钟，pbs洗涤，400目筛网过滤，流式细胞仪上机检测。bios consort30软件系统处理数据，计算阳性细胞标记率，结果扫描图和数据表示方式显示并打印。统计分析处理（x2检验）比较阴性对照组细胞和试验组细胞间有无显著性差异。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
光学显微镜下，正常生长的细胞大多呈椭圆形，胞体较大，界限清楚（图1）。
图1 表皮细胞正常光镜图
2.2重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响
通过mtt 法测定细胞的增殖，rhegf在浓度为5～100 ng·ml-1均可以促进人表皮细胞的生长，在10 ng·ml-1时促进细胞的生长作用最为明显。
图2 重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响
2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达
rhegf处理组的细胞在dna合成前期减少，而处于dna合成期的细胞增加，增殖率较对照组明显增高, s和g2/m期细胞数增加，g0/g1细胞数减少。表明重组人表皮细胞生长因子可以促进表皮细胞的分裂增殖。基因产物表达含量分析，rhegf处理细胞后与细胞生长相关基因的表达出现明显的变化，cmyc的标记率和表达量明显升高, cfos和cjun表达量也明显升高，结果见图3。
图3重组人表皮细胞生长因子对细胞增殖指数及细胞生长相关基因的蛋白表达
2讨论
表皮生长因子（egf）是广泛存在于人体多种组织的一种多肽因子，具有刺激上皮细胞增生，加快创伤愈合的作用[1]。随着分子生物学的研究进展,人们对创面愈合的调控机制认识不断深化。愈合能力差除与创面产生原因有关外,还与创面本身修复内环境的改变、内源性生长因子含量低下或受体活性下调等因素有关。生长因子在创伤修复中起着举足轻重的作用,调控着创伤的修复。egf与其受体结合可激活直接调控或诱导细胞增殖的调节生长基因，参与体表创伤的愈合过程，并且为表皮的高速更新所必须。在创伤修复过程中，由于机体本身对创伤部位的修复机制，内源性egf在创面明显积累，但由于组织中的egf含量普遍较低，难以满足细胞增殖和肉芽组织发育的需要，因此，理论上外源性的egf可加速创面的愈合速度[3]。 重组人表皮生长因子利用基因重组技术人工合成，其结构与天然产物一致，具有促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较好的临床应用价值。我们研究表明，应用细菌发酵法获得的rhegf对人表皮细胞具有增殖作用，而且在10 ng·ml-1时作用最为明显。流式细胞术的进一步研究表明rhegf处理细胞48h后处于dna合成期的细胞增加，细胞增殖率分别较阴性对照组增加。研究发现cmyc基因与细胞增殖有关，并且与不同的基因群协同控制细胞增殖与分化，参与细胞的调控特别是g0～g1期的过渡。cfos基因蛋白cfos可以识别和结合到基因组中特定的调控序列，从而调控细胞的增殖和分化。cjun所编码的蛋白质对细胞增殖分化中必不可少的基因表达进行调控。我们的研究表明，rhegf处理表皮细胞后cmyc的标记率和表达量明显升高, cfos和cjun表达量也明显升高，提示rhegf可以通过与细胞周期有关的基因促进细胞的分裂增殖。
【参考文献】
1 jahovic n, guzel e, arbak s et al. the healingpromoting effect of saliva on skin burn is mediated by epidermal growth factor (egf): role of the neutrophils[j]. burns, 2004, 30(6): 531538.
2 nagelschmidt m, becker d, bonninghoff n et al.effect of fibronection therapy and fibronection deficiency on wound healing: a study in rats [j].j trauma, 1987, 27(1): 1267-1271.
细胞增殖论文范文第6篇
【关键词】 重组人表皮细胞生长因子；人表皮细胞；增殖
细胞增殖、分化、成熟的调控依赖多种活性蛋白质及多肽，统称为生长因子。目前已发现包括表皮生长因子(epidermal growth factor, egf)在内的多种生长因子。重组人表皮生长因子(recombinant human egf，rhegf)是通过人工合成的表皮生长因子基因片段在大肠杆菌表达系统进行有效表达而获得的可促进多类细胞生长的多肽类物质, 其活性和结构与天然产物高度一致[1]。具有广泛的促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较大的临床应用价值。在制备过程中不同的提取以及纯化方法对多肽的活性影响较大，本文就应用细菌发酵法获得的rhegf对人表皮细胞的增殖作用进行研究。
1材料及方法
1.1试剂
重组人表皮生长因子，细菌发酵法获得。dmem、prmi1640培养基为美国gibeo产品，小牛血清、胎牛血清为成都哈里生物工程有限公司；mtt为美国sigma产品。
1.2实验方法及结果
1.2.1表皮细胞取材以及培养包皮环切术后标本，pbs洗涤三次，眼科剪剔除多于皮下组织；25%trypsin冷消化过夜，分离表皮与真皮，并去除真皮，制备细胞悬液；1000 rpm×10 min离心，去上清，培养基重新混悬细胞沉淀，用血细胞计数仪计数，并用台盼兰染色，了解细胞存活率。将上述细胞悬液按一定细胞密度接种于培养皿中，置37 ℃，5%co2孵箱中；2天～3天换液一次；当细胞长满瓶皿70～80%时，根据需要传代或冻存细胞。
1.2.2mtt 法测定细胞的增殖取对数生长期细胞1.5×105接种于96 孔培养板内，每孔100 μl，设6 个复孔。加rhegf使浓度为 0,5,10，20,50,100 ng·ml-1及调零孔加100 μl培养液，继续培养48 h，结束前4 h，加10 μl mtt,常规终止实验，与酶联免疫检测仪上测各孔吸光值，波长490 nm。按下列公式计算相对增殖率（relative growth rate, rgr）：rgr = 给药孔吸光度值/对照孔吸光度值×100%。
1.2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达接种2×105个细胞于75ml培养瓶中，待细胞贴壁后加入不同浓度的rhegf作用于细胞48小时，收集细胞，流式细胞仪检测细胞的增殖，根据细胞周期时相，计算细胞的增殖指数（pi）：pi=(s+g2/m) / (g0/g1+s+g2/m)×100% 。基因产物表达含量分析：上机检测前用pbs 洗离心除去固定液，冰冷pbs 洗涤细胞3 次，按免疫组化方法分别加入cmyc, cfos和cjun单抗,使用浓度1∶100，然后加入荧光素标记的二抗igg,37 ℃作用30分钟，pbs洗涤，400目筛网过滤，流式细胞仪上机检测。bios consort30软件系统处理数据，计算阳性细胞标记率，结果扫描图和数据表示方式显示并打印。统计分析处理（x2检验）比较阴性对照组细胞和试验组细胞间有无显著性差异。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
光学显微镜下，正常生长的细胞大多呈椭圆形，胞体较大，界限清楚（图1）。
图1 表皮细胞正常光镜图
2.2重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响
通过mtt 法测定细胞的增殖，rhegf在浓度为5～100 ng·ml-1均可以促进人表皮细胞的生长，在10 ng·ml-1时促进细胞的生长作用最为明显。
图2 重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响
2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达
rhegf处理组的细胞在dna合成前期减少，而处于dna合成期的细胞增加，增殖率较对照组明显增高, s和g2/m期细胞数增加，g0/g1细胞数减少。表明重组人表皮细胞生长因子可以促进表皮细胞的分裂增殖。基因产物表达含量分析，rhegf处理细胞后与细胞生长相关基因的表达出现明显的变化，cmyc的标记率和表达量明显升高, cfos和cjun表达量也明显升高，结果见图3。
图3重组人表皮细胞生长因子对细胞增殖指数及细胞生长相关基因的蛋白表达
2讨论
表皮生长因子（egf）是广泛存在于人体多种组织的一种多肽因子，具有刺激上皮细胞增生，加快创伤愈合的作用[1]。随着分子生物学的研究进展,人们对创面愈合的调控机制认识不断深化。愈合能力差除与创面产生原因有关外,还与创面本身修复内环境的改变、内源性生长因子含量低下或受体活性下调等因素有关。生长因子在创伤修复中起着举足轻重的作用,调控着创伤的修复。egf与其受体结合可激活直接调控或诱导细胞增殖的调节生长基因，参与体表创伤的愈合过程，并且为表皮的高速更新所必须。在创伤修复过程中，由于机体本身对创伤部位的修复机制，内源性egf在创面明显积累，但由于组织中的egf含量普遍较低，难以满足细胞增殖和肉芽组织发育的需要，因此，理论上外源性的egf可加速创面的愈合速度[3]。 重组人表皮生长因子利用基因重组技术人工合成，其结构与天然产物一致，具有促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较好的临床应用价值。我们研究表明，应用细菌发酵法获得的rhegf对人表皮细胞具有增殖作用，而且在10 ng·ml-1时作用最为明显。流式细胞术的进一步研究表明rhegf处理细胞48h后处于dna合成期的细胞增加，细胞增殖率分别较阴性对照组增加。研究发现cmyc基因与细胞增殖有关，并且与不同的基因群协同控制细胞增殖与分化，参与细胞的调控特别是g0～g1期的过渡。cfos基因蛋白cfos可以识别和结合到基因组中特定的调控序列，从而调控细胞的增殖和分化。cjun所编码的蛋白质对细胞增殖分化中必不可少的基因表达进行调控。我们的研究表明，rhegf处理表皮细胞后cmyc的标记率和表达量明显升高, cfos和cjun表达量也明显升高，提示rhegf可以通过与细胞周期有关的基因促进细胞的分裂增殖。
【参考文献】
1 jahovic n, guzel e, arbak s et al. the healingpromoting effect of saliva on skin burn is mediated by epidermal growth factor (egf): role of the neutrophils[j]. burns, 2004, 30(6): 531538.
2 nagelschmidt m, becker d, bonninghoff n et al.effect of fibronection therapy and fibronection deficiency on wound healing: a study in rats [j].j trauma, 1987, 27(1): 1267-1271.
细胞增殖论文范文第7篇
方法：不同浓度的皮鳞癌一号方作用于A431细胞24h、48h、72h后，采用四甲基偶氮唑蓝（M1Tr）显色法检测细胞增殖抑制率。
结果：MTT法显示，随着皮鳞癌一号方作用的时间延长及剂量增加对A431细胞增殖的抑制作用增强，有明显的时间和剂量依赖性，与对照组比较差异有显著性（P
结论：皮鳞癌一号方具有抑制人皮鳞癌A431细胞的增殖及诱导细胞凋亡作用。
关键词：皮鳞癌一号方 A431细胞 细胞周期
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）10-0002-01
本实验选取的皮鳞癌一号方由遵义医药高等专科学校提供，每ml试液相当于生药2g，以其中所含白头翁中的三萜类皂苷含量作为质量评价标准。本研究通过体外实验，从皮鳞癌A431细胞周期探讨皮鳞癌一号方对SCC的影响。
1 材料
1.1 药物。皮鳞一号方由白头翁、莪术等中药组成，试验品由遵义医药高等专科学校提供，每ml相当于生药2g，以白头翁皂苷B4含量及浸膏收率作为质量控制标准，低温保存备用。
1.2 试剂。高糖的DMEM、胎牛血清购自Hyclone公司，MTT购自Amresco公司（201105）。
1.3 细胞系。A431细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。
2 方法
2.1 细胞培养。A431细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素（100U/L）和链霉素（100U/L）的高糖DMEM培养基中，置于5%CO2、37℃和饱和湿度的培养箱中。
2.2 MTT法测定皮鳞癌一号方对A431细胞的增殖抑制作用。取对数生长期的细胞，调整细胞密度为1.25×105/ml，160μl/孔接种于96孔板。培养24h后，每孔加40μl不同浓度的药物，药物浓度设5个梯度，分别为原药的1/400、1/200、1/100、1/50、1/25。同时设空白调零组（加200μl无血清培养基）、阴性对照组（不加药物）、阳性对照组（5-Fu10μg/ml）。因皮鳞癌一号方有颜色，加设不同浓度颜色对照组。分别培养24h、48h、72h后，弃去上清，加200μl无血清培养基及20μlMTT（5mg/ml），置于二氧化碳培养箱培养4h后，弃上清，加150μlDMSO，振荡10min后，于酶联免疫检测仪490nm处测定吸光度值（OD值）。实验重复三次。
细胞生长抑制率（%）=1-（实验组OD-颜色对照组OD/阴性对照组OD-空白调零组OD）×100%。
2.3 统计学方法。采用SPSS13.0软件进行统计分析，所有计量资料用X±S表示，多组间比较采用单因素方差分析，所有检验均为双侧检验，并以α=0.05作为检验水准。P
3 结果
MTT法测定皮鳞癌一号方对A431细胞的增殖抑制作用。在浓度为1/400，1/200，1/100，1/50，1/25作用于A431细胞24h、48h、72h后，与阴性对照组比较，各浓度组对A431细胞均有增殖抑制作用，且随着药物浓度的增高和作用时间的延长，其对A431细胞的增殖抑制作用愈明显。见表1。
4 讨论
细胞周期是由DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（s期）、DNA合成后期（G2期）、有丝分裂期（M期）组成。在细胞增殖周期中，G1期、s期、G2期、M期各自起到非常重要的作用。此外，细胞还可以从G1期暂时离开细胞周期，停止有丝分裂，进入G0期（静止期）。在G0期细胞接受外部信号刺激，决定细胞是进入S期进行DNA复制并完成分裂发生恶性增殖还是进入相对静止期G0期。如果阻止细胞由G0期进入S期，则肿瘤细胞的无限增殖可以得到控制[2]。
本实验显示：在浓度为1/400，1/200，1/100，1/50，1/25作用于A431细胞24h、48h、72h后，各浓度组对A431细胞均有增殖抑制作用。表明皮鳞癌一号方可以抑制皮鳞癌A431细胞增殖。
参考文献
细胞增殖论文范文第8篇
【摘要】：目的研究颅内生殖细胞瘤的影像学特征。方法收集我院2008年4月至2012年8月收治的经手术和病理证实为颅内生殖细胞瘤的54例患者的临床资料，这些患者的影像资料都是完整的，然后进行影像学分析。结果54例患者中，有28例患者为松果体区生殖细胞瘤，占颅内生殖细胞瘤总数的51.9%；21例患者为鞍区生殖细胞瘤，5例患者为丘脑和基底节区生殖细胞瘤。松果体区生殖细胞瘤是等T1、等或稍长的T2信号，具有均匀、明显强化的特征；依据具体部位的不同，可以将鞍区生殖细胞瘤囊分为三类；丘脑和基底节区生殖细胞瘤多表现为混杂T1和混杂长T2信号，具有斑片样、囊壁环形分隔样增强等特征。结论颅内生殖细胞瘤的发病年龄、性别及MRI比较特殊，一般情况下可以做出正确诊断。
【关键词】：颅内生殖细胞瘤；影像学特征
在颅内肿瘤的发病率中，生殖细胞瘤占到1-2%，其多发地区为亚洲。颅内生殖细胞瘤是最为常见的生殖细胞肿瘤，松果体区生殖细胞瘤可占颅内生殖细胞瘤总数的50%以上。对我院2008年4月至2012年8月收治的经手术和病理证实为颅内生殖细胞瘤的54例患者的临床资料和MRI特征进行回顾性分析，以促进诊断水平的有效提升，现报告如下。
1.资料和方法
1.1一般资料
54例患者均经手术和病理证实为颅内生殖细胞瘤，其中有48例男性患者，6例女性患者，年龄在8～33岁之间，平均年龄为15岁，其中18岁以下的未成年患者有45例，占总病例的83%。病程为15天至30个月，平均病程为11个月。有28例患者病变部位为松果体区，占总病例的52%，21例患者病变部位为鞍区，占总病例的39%，5例患者病变部位为丘脑和基底节区，占总病例的9%。
1.2影像学检查方法
采用GEBrightspeed多层螺旋CT机作为扫描机，层间距和层厚都是5mm。先进行平扫，然后进行增强扫描，欧乃派克或优雅先可作为对比剂，用量为300mg/ml，推注时使用CT专用高压注射器，注射剂量是80～100ml，注射流率是3ml/s。对所有患者采用1.5TMR成像仪进行MRI检查，使用头部专用线圈，自旋回波序列（SE）应用于T1WI中，快速自旋回波序列（FSE）应用于T2WI中；国产（北陆）磁显葡胺（Gd-DTPA）是在对扫描进行增强时所采用的对比剂，剂量是0.1mmol/kg，经肘静脉向后行矢状面、横断面及冠状面快速注入，然后进行T1WI扫描。本组54例患者中，对8例患者只行CT检查，对18例患者只行MRI检查，对其余28例患者同时行CT和MRI检查[1]。
1.3观察指标
对患者的颅内压增高症状、研究运动障碍、小脑症状等进行认真细致的观察。MRI影像观察指标为肿瘤位置、生长方向、囊变坏死、增强后的肿瘤强化程度等。
2.结果
本组54例患者中行头颅CT检查的患者在检查之后显示，病变位于鞍区的有28例患者，占颅内生殖细胞瘤总数的51.9%，表现为圆形、椭圆形混杂密度，具有清晰的边缘，如果增强CT扫描，可见病灶呈均匀强化，和平时相比，病灶范围略有增加，生殖细胞瘤是等T1、等或稍长的T2信号，具有均匀、明显强化的特征；行MRI检查的患者在检查之后显示，依据具体部位的不同，可以将鞍区生殖细胞瘤囊分为三类，21例患者为鞍区生殖细胞瘤，5例患者为丘脑和基底节区生殖细胞瘤。丘脑和基底节区生殖细胞瘤多表现为混杂T1和混杂长T2信号，具有斑片样、囊壁环形分隔样增强等特征。
3.讨论
生殖细胞肿瘤十分常见，下至新生儿上至老年人都可发生，但青少年最多见。肿瘤的病理类型不同，发生的最小年龄和平均年龄就会不同，生殖细胞瘤发生的最小年龄是6岁，12～14岁是发病的高峰；平均年龄是10岁。松果体区生殖细胞瘤由于所具有的病理组织类型不同而具有不同的CT征象，可表现为类圆形、圆形等，可呈等密度、等高混杂密度等。生殖细胞瘤大多有钙化，具有不规则的边界，多表现均匀一致的强化。
一般情况下，松果体区生殖细胞肿瘤位于中线，相对于CT来说，MRI能够更好地将肿瘤的大小和部位显示出来。如果肿瘤比较小，CT就很容易将其遗漏掉。如果中脑导水管或大脑大静脉受压，在MRI上就会表现出上述流空效应减弱，这是一种较早的间接征象，发生原因是较小的肿瘤受到了轻度占位效应，而部分正常人的松果体会呈现囊性，大小可达10～15mm，和脑脊液信号相比，T1？和T2加权像都比较高。在T1加权像下，生殖细胞瘤都呈等信号[2]。肿瘤可沿脑脊液种植播散，因此在对其进行检查时应该将矢状位和冠状位包括在内，尽可能也包括颈段椎管的一部分，如果不太相信检查结果，应该做Gd-DTPA增强扫描。由于生殖细胞瘤对放射治疗十分敏感，因此在治疗之后MRI异常信号就会消失。
终上所述，颅内生殖细胞瘤的发病年龄、性别及MRI比较特殊，一般情况下可以做出正确诊断。
参考文献
细胞增殖论文范文第9篇
【关键词】 雷帕霉素； 肝移植； 冷保存； 再灌注； 胆管上皮细胞； 增殖
【Key words】 Rapamycin; Liver transplantation; Cold preservation; Reperfusion; Biliary epithelial cells; Proliferation
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
兔抗增殖细胞核抗原多克隆抗体、鼠抗pSTAT3tyr705单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；ChemMateTM Envision免疫组化试剂盒为丹麦Dako公司产品；RPM为美国惠氏百宫制药公司惠赠。
1.3 各组术后生存分析
1.4 肝功能指标检测
1.5 兔抗增殖细胞核抗原、α平滑肌肌动蛋白免疫组织化学检测
肝组织常规固定、包埋、切片。采用兔抗增殖细胞核抗原作为细胞增殖期G1S期的评价指标，α平滑肌肌动蛋白作为肌纤维母细胞标志。按ChemMateTM Envision免疫组化试剂盒说明书操作。显微镜下观察α平滑肌肌动蛋白表达阳性细胞的胞质呈棕色，增殖细胞的胞核呈棕色。计算7个高倍镜(×400)视野内，每100个胆管细胞中增殖的胆管上皮细胞所占比例的均值作为该样本的胆管上皮细胞增殖率［4］。
1.6 统计学分析
计量资料以±s表示，所有数据应用SPSS 10.0软件进行统计分析，多组均数间的比较采用单因素方差分析，采用KaplanMeier法绘制生存曲线，Logrank法检验各组生存率之间的差异。
2 结果
2.1 各组术后生存分析
冷保存12 h组生存率明显低于冷保存1 h组(P=0.017 4)，而与雷帕霉素组水平接近(P=0.89，图1)。两组大鼠死亡的主要原因为移植肝肝功能不全，表现为肝脏淤血或伴有局灶性坏死，腹水、黄疸，肝功能酶谱升高，部分死亡大鼠胆管内可见褐色胆泥形成。
图1 各组肝移植术后生存曲线
2.2 各组肝功能检测
2.3 各组胆管上皮细胞增殖
2.4 胆管周围肌纤维母细胞分布
图2 肝移植术后胆管上皮细胞增殖(红色箭头所示为增殖细胞) (2氨基联苯胺染色 ×400)
图3 肝移植术后肌纤维母细胞分布(红色箭头所示为肌纤维母细胞) (2氨基联苯胺染色 ×400)
3 讨论
残存的胆管上皮细胞在对损伤做出再生修复时，虽然最终能恢复到近似原先的细胞形态，但在该过程中极有可能经历DNA损伤或基因序列改变，具有和正常细胞不同的功能，分泌多种与器官纤维化密切相关的细胞因子如TGFβ等，促进胆管周围成纤维细胞活化转化为肌纤维母细胞，而后者的持续出现是器官纤维化过程的关键［6］。同时，大量而活跃的细胞分裂需要消耗较多的能量，就有可能削弱肝内非新生细胞正常的能量代谢过程［7］。这对移植物的长期存活及功能是不利的。我们观察到伴随着明显的胆管上皮细胞增殖，较多肌纤维母细胞环绕于冷保存12 h组胆管周围。这表明严重冷保存再灌注诱导的胆管上皮细胞增殖可能是促进肌纤维母细胞聚集的重要因素。由于胆管上皮细胞和胆管周围肌纤维母细胞之间维持着非常精妙的平衡，冷保存再灌注对胆管上皮细胞的严重损伤触发肌纤维母细胞的大量活化，导致胆管壁创面收缩，增加了胆管壁及其周围组织纤维化和胆管狭窄形成的风险，在肝外胆管或肝内大胆管常表现为管腔狭窄，在小胆管则可能出现管腔阻塞［8］。我们还观察到大胆管尤其肝门附近大胆管内壁的胆管上皮细胞增殖最为活跃，该区结缔组织丰富，内含大量成纤维细胞，极易受到胆管上皮细胞增殖的影响而活化为肌纤维母细胞。这也许正是临床观察到的肝门附近大胆管成为移植肝胆道狭窄易患部位的原因之1，也是影响移植物功能与存活的重要因素。
作为1种新型免疫抑制剂，体外和体内实验均证实雷帕霉素抑制胆管上皮细胞增殖，其有效抑制浓度远低于临床肝移植术后患者应用雷帕霉素作为免疫抑制剂时的血药浓度［9］。我们的研究也发现，雷帕霉素明显抑制由冷保存再灌注损伤诱导的胆管上皮细胞增殖，并减少胆管周围肌纤维母细胞的聚集。雷帕霉素是信号转导及转录激活因子3活化的特异性抑制剂，因而部分阻断转录激活因子3介导的信号通路，从而调控细胞周期进展，影响细胞增殖与分化［10］，这可能是其抑制胆管上皮细胞增殖的分子机制之1。同时我们还观察到，雷帕霉素虽然明显抑制肝移植术后胆管上皮细胞的增殖，但并未降低术后14 d内生存率，进1步提示以胆管上皮细胞增殖为靶点的雷帕霉素极可能成为临床防治移植肝胆管周围纤维化、胆管狭窄等并发症的有力武器，将会更广泛地应用于肝移植领域。
【参考文献】
［2］ Ramadori G, Saile B. Portal tract fibrogenesis in the liver. Lab Invest,2004,84(2):153-159.
细胞增殖论文范文第10篇
【关键词】卵巢浆液性状囊腺癌；雌二醇；雌激素受体抑制剂ICI 182 780；细胞凋亡
【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0033-04
前言
卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，卵巢上皮性恶性肿瘤占原发卵巢恶性肿瘤的50%-70%，由于缺乏早期诊断手段，其5年生存率为30%～40%，病死率居妇科肿瘤首位【1】。许多研究表明雌激素与上皮性卵巢癌的发生、发展有着密切的关系，雌激素的使用增加了女性患卵巢癌的风险【2-4】，亦会增强卵巢癌细胞迁移的倾向，即增加转移的机率【5】。也有研究表明口服避孕药可以降低卵巢癌发生率和死亡率【6】。但目前关于雌激素在卵巢癌中的作用机制尚不十分清楚。
研究表明，上皮性卵巢癌中广泛存在雌激素受体的高表达【7】，雌激素对体外卵巢癌细胞生长的调控是细胞类型特异性的，其机制可能与细胞内雌激素受体的不同表达有关。同一浓度的E2作用于不同来源的卵巢癌细胞，其作用效果是有差别的，激素受体阳性的癌细胞较阴性的敏感【8】。ICI 182 780（氟维司群）是一种甾体类选择性雌激素受体调节剂，是ER的特异性拮抗剂，其通过加速ER降解而下调ER，可使癌细胞不进入细胞周期从而对抗雌激素的促增殖作用，ICI 182 780无雌激素样作用，已成为治疗晚期乳腺癌的新一代有效药物【9】。由此推测，雌激素受体特异性拮抗剂ICI 182 780，可能对上皮性卵巢癌有一定的治疗效果。
本实验以卵巢浆液性状囊腺癌SKOV3细胞系为研究对象，通过体外实验探讨雌激素及其受体抑制剂在卵巢癌细胞生长中的作用机制，以期为上皮性卵巢癌的临床治疗提供理论依据。
材料与方法
一、材料
（一）主要仪器
1）无菌工作台：Terra Universal Inc，USA
2）二氧化碳培养箱：Heracus，Germany
3）光学显微镜：Olympus，Japan
4）台式高速离心机： Sigma，USA
5）100、1000ul的微量加样器： Brand，USA
6）全自动酶标仪： Bio-rad，USA
7）超速低温离心机： Beckman，USA
8）流式细胞仪： Facs Vantagese，USA
9）6、96孔细胞培养板、25cm2培养瓶： 大连绿竹科技有限公司
（二）药物及试剂
1.试剂
二甲基亚砜（DMSO）：AMRESCO公司，-20℃保存；
胎牛血清：GIBCO公司，-4℃保存；
Dextran-charcoal-stripped FCS：MultiSer公司，-4℃保存；
DMEM培养基：GIBCO公司，临用前按浓度为10%加入胎牛血清，-4℃保存；
AnnexinV-FITc凋亡测试试剂盒：南京凯基生物制品有限公司，-4℃保存。
2. 药物
雌二醇（E2）及其受体抑制剂氟维司群（ICI 182 780）：美国sigma公司，分子量分别为272.39、606.77，无水乙醇配成0.001 mol/L原液，E2在4℃保存，ICI 182 780常温保存备用。
（三）实验用细胞系
卵巢癌细胞株SKOV3来自人卵巢浆液性状囊腺癌细胞，购于南京凯基公司，大连医科大学附属第一医院中心实验室传代培养。
（四）实验用液的制备：
PBS液：（0.1M，PH7.2-7.4）：PBS粉置于大烧杯，加三蒸水，玻璃棒搅拌均匀，定容至1000ml。调整PH值为7.4后分装至玻璃瓶封口，置高压锅中高压灭菌。灭菌后的PBS液置-4℃冰箱中备用，1月内有效。
MTT溶液的制备（5mg/mL）：称取250mgMTT粉放入小烧杯中，加入40ml已配好的PBS液，搅拌均匀，补足PBS液至50ml，超净台中用0.22um的微孔滤器灭菌，分装。避光-20℃冰箱保存1个月有效。
胰酶的制备（0.25%）：GIBCO公司，称取胰酶粉末0.25g，用PBS液100ml充分溶解，超净台中用0.22um的微孔滤器灭菌，4℃冰箱保存备用。
台盼蓝染液（0.4%）：称取固体台盼蓝（Trypan blue）0.4g，溶于PBS液100ml，过滤固体杂质，封存备用。
二、方法
（一）细胞培养与传代
1.细胞培养
将卵巢癌细胞株SKOV3于DMEM培养液（含10%胎牛血清、1.5mmol/L谷氨酰胺、青链霉素各100IU/ml，PH7.2-7.4），37℃、5%CO2培养箱中培养，每48h更换培养液。将对数生长期细胞冻存备用。实验前将上述细胞用不含phenol red但包含5%dextran-charcoal-stripped FCS的DMEM培养液连续培养5-7天再进行实验（每48h换培养液）【10】。
2.细胞传代
当细胞铺满瓶底80%-90%时传代。取出培养瓶，超净台中，弃培养液，PBS溶液冲洗两遍，加入0.25%的胰酶约1ml，旋转培养瓶使胰酶覆盖细胞层，超净台中静置1-2min，倒置显微镜下观察，当细胞收缩变圆，细胞间隙增大时，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用滴管将细胞吹打制成单细胞悬液，将细胞悬液移装入离心管中，3000rpm/min离心10min，见细胞沉淀于管底，倒掉培养液（含胰酶），加入DMEM培养液，调整细胞浓度为1×103～1×104个/ml，分装接种到培养瓶，培养箱中继续培养。
（二）实验分组
细胞计数实验分组：细胞对照组，E2组及（E2+ICI）组（药物终浓度为lO-7mol/L、lO-11mol/L）。
MTT实验设计分组为：DMEM培养液空白对照组，细胞对照组，E2组及（E2+ICI）组（药物终浓度为lO-5mol/L、lO-7mol/L、lO-9mol/L、lO-11mol/L、lO-13mol/L）。
流式细胞仪检测细胞凋亡分组：细胞对照组，E2组及（E2+ICI）组（药物终浓度为lO-7mol/L、lO-9mol/L、lO-11mol/L）。
（三）实验操作步骤
1.细胞计数法
1）收集含5%dextran-charcoal-stripped FCS的DMEM培养液培养5-7天的SKOV3细胞，胰酶消化后制备单细胞悬液，并调整细胞悬液浓度为1×104个/ml。
2）铺板：用微量加样器将上述单细胞悬液按每孔100ul接种于96孔板中培养（即每孔细胞数约1×103个）。每接种3个孔再次吹打细胞悬液，使每孔的细胞均匀一致的铺于孔底。做好标记后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育贴壁。
3）加药：用上述DMEM培养液稀释E2及（E2+ICI 182 780）至终浓度为lO-7mol/L、lO-11mol/L，细胞贴壁后取出96孔板，镜下观察确定细胞单层均匀贴附在孔底后，超净台中小心弃上清，依次加入100ul的药物，置于培养箱中继续培养（每48h更换含同浓度药物的培养液），每24h进行一次细胞计数，共计数6天，每个浓度每个时间点设4个平行孔；同时设阴性对照组即细胞对照组。
4）细胞染色：取出96孔板，于超净台中，PBS冲洗即要计数的细胞，50ul胰酶消化，加入100ulDMEM终止消化，并吹打成均匀单细胞悬液，取10ul移入EP管中，并加入10ul浓度为0.4%的台盼蓝染液，吹打混匀，室温下染色3-5min（注意时间过长会导致活细胞亦会被染色）。
5）细胞计数：染色过的细胞材料，取10ul细胞悬液于细胞计数板上，加盖玻片后放荧光显微镜下观察：死亡的细胞着浅蓝色并膨大，无光泽；活细胞不着色并保持正常形态，有光泽。进行活细胞计数[细胞数=计数板四格活细胞总数×（10/4）×104]，每孔计数重复3次，取平均值，共计数6d。重复实验3次。
6）根据计数数值进行统计学分析，并描绘细胞增殖曲线。
2.MTT法
1）单细胞悬液的制备：同上。
2）铺板：同上方法接种于96孔板的60个孔底，为了避免边缘效应，96孔板边缘的36孔加入PBS液。做好标记后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育贴壁。
3）加药：同上依次加入100ul终浓度为lO-5mol/L、lO-7mol/L、lO-9mol/L、lO-11mol/L、lO-13mol/L的E2及（E2+ICI 182 780），置于培养箱中继续培养24及48小时，每个药物浓度组每个时间点设5个平行孔；同时设对照组，包括细胞对照组和只含有DMEM培养液的空白对照组。
4）加入MTT：在每一时间点取样前，避光加入5mg/ml的MTT液20ul， 培养箱中继续培养4h。
5）酶标仪测OD值：终止培养，轻轻弃去上清，每孔加入150ul二甲基亚砜（DMSO），微量振荡器振荡8min，结晶充分溶解后酶标仪测定每孔490nm的吸光值（OD490），重复实验3次。
6）细胞增殖抑制率的计算：抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值*100%【11】。
3.流式细胞术检测细胞凋亡率
1）单细胞悬液的制备同上，并调整细胞浓度为1×105个/ml。
2）铺板：将上述单细胞悬液按每孔2ml接种于6孔板。置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。
3）加药：细胞贴壁后，弃原培养液，依次加入2ml终浓度分别为lO-7mol/L、lO-9mol/L、lO-11mol/L的E2及（E2+ICI 182 780），置于培养箱中继续培养24及48小时，每个浓度每个时间点设4个平行孔；同时设阴性对照组即细胞对照组。
4）流式细胞仪检测细胞凋亡：取出6孔板，胰酶消化收集细胞（为更准确测得凋亡细胞，原培养液不丢弃），置于离心管中，离心（2000rpm，5min），加入500μl Annexin V Binding Buffer；再加入5μl的Annexin V―FITc 混匀后，加入5μl的Propidium Iodide，混匀；避光室温反应10分钟，流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。（Ex=488nm，Em=530nm）
（四） 统计方法：
所得数据采用均数±标准差（±s）表示，利用SPSS16.0软件进行数据处理，进行单因素方差分析，检验水准α=0.05，P
结果
一、细胞计数法结果（见表1及附图2-4）
1）细胞培养24h后，10-11mol/L浓度E2组细胞（1.73×104个/ml）比10-7mol/L浓度E2组（1.06×104个/ml）增殖明显（P0.05）。
2）各组细胞增殖曲线如图2所示，对照组细胞在前4天呈直线上升，第5、6天增殖速度变缓。其余各组与对照组呈同样的增长趋势，但10-7mol/L浓度E2组与对照组比较，细胞增殖明显受抑制，而10-11mol/L浓度E2组细胞增殖较对照组增高，加入同浓度的ICI 182 780，E2的促进或抑制增殖作用则明显受抑制。
3）10-7mol/L浓度E2组及10-11mol/L浓度E2组的第2、3、4天的细胞计数值，分别与对照组比较，高浓度组抑制细胞增殖，低浓度组促进细胞增殖，均具有统计学意义（P
加入与E2相同浓度的ICI 182 780后，10-7mol/L浓度组抵消了E2的增殖抑制作用，增殖曲线虽仍低于对照组，但差异无显著统计学意义（P>0.05）；而10-11mol/L浓度组不仅完全抵消了E2的增殖促进作用，还显示了明显的抑制增殖作用，增殖曲线低于对照组，培养2、3、4天时的细胞增殖数均明显低于对照组（>0.05）。
二、MTT法检测结果（如表2所示）
1）当E2浓度在10-7～10-5 mol/L的浓度范围内，应用24h后的细胞增殖抑制率是16.9%～25.6%，用药48h后抑制率增加到21.4%～30.3%，且随着时间的延长、浓度的增加，抑制率明显增加，均具有统计学差异（P
加入同浓度的ICI 182 780时，用药24h后的抑制率是9.7%～17.5%，用药48h后抑制率增加到10.3%～18.4%，与对照组相比，亦有抑制细胞生长的作用（P
2）当E2浓度为10-9 mol/L时，24h、48h增殖抑制率分别为1.7%、1.2%，但与对照组无显著差异（P>0.05），加入等浓度ICI182 780，与对照组比较，明显抑制了SKOV3细胞的增殖（P
3）当E2浓度为10-13～10-11 mol/L时，具有促细胞增殖作用，24h细胞增殖抑制率为-5.6%～-7.3%，48h胞增殖抑制率为-8.9%～-10.7%，10-13 mol/L浓度组的促增殖作用有所减弱，但与10-11 mol/L无明显统计学差异（P>0.05）。同浓度的ICI 182 780可以完全抵消E2的促增殖作用，与对照组比较无差异（P>0.05）。
三、流式细胞仪检测细胞凋亡率的结果（如表3、图5所示）
1）SKOV3细胞在10-7mol/L浓度E2作用24h、48h后的总凋亡率分别为26.11%、17.72%，均明显高于对照组（总凋亡率为6.72%、6.76%），差异有统计学意义（P
加入相同浓度的ICI 182 780，24h、48h总体凋亡率分别为11.95%、13.87%，与E2组（26.11%、17.72%）相比，具有显著的统计学差异（P
2）当药物浓度在10-11mol/L、10-9mol/L时，E2组SKOV3细胞的总体凋亡率及早期凋亡率与对照组均无明显差异（P>0.05）；加入相同浓度ICI 182 780作用24h的总凋亡率分别为11.79%、14.79%（早期凋亡率分别为10.38%、12.21%），48h的总凋亡率为10.90%、13.15%（早期凋亡率分别为9.17%、11.43%），均高于对照组及E2组，具有统计学差异（P
3）各组别的机械损伤和晚期凋亡的比例，两两比较，均无统计学意义（P>0.05）。
讨论
一、E2及ICI 182 780对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响
女性体内E2 浓度在不同生理时期是不断变化的，青春前期及绝经后期其值为最低，排卵期值为最高值，其范围是1.8*10-11～2.2*10-9mol/L【1】。本实验选择了高低两个药物浓度分别为10-7mol/L、10-11mol/L，进行细胞培养，并描绘细胞增殖曲线。结果提示第2、3、4天细胞计数结果提示10-7mol/L 浓度E2抑制SKOV3细胞的增殖，10-11mol/L浓度E2促进细胞增殖；各浓度组加入ICI 182 780，对抗了E2的促增殖或抑制增殖作用，细胞增殖曲线均低于对照组，提示ICI 182 780不仅对抗雌二醇的作用，还可能直接抑制细胞增殖的作用，这一点与目前的研究结果相一致【12】。
在此结果基础上，本实验采用MTT法检测不同浓度药物对SKOV3细胞增殖的影响，结果提示高浓度E2抑制SKOV3细胞的生长，E2浓度在10-7～10-5mol/L的浓度范围内，应用24h后的细胞增殖抑制率是16.9%-25.6%，用药48h后抑制率增加到21.4%-30.3%，且随着时间的延长、浓度的增加，抑制率明显增加；当E2浓度为10-9mol/L时，细胞抑制率明显减弱至与对照组相近（P>0.05）；E2浓度为10-13～10-11 mol/L时，具有促细胞增殖作用，其中10-13mol/L浓度组的促增殖作用较10-11mol/L浓度组有所减弱，但无明显统计学意义（P>0.05），提示激素可能对癌细胞生长存在剂量依赖作用；加入相同浓度ICI 182 780后，高浓度组（10-7～10-5 mol/L）部分抵消了E2的细胞增殖抑制作用，但仍低于对照组（P
二、E2及ICI 182 780对人卵巢癌SKOV3细胞抑制增殖的可能机制
细胞凋亡是由多种基因调控的主动死亡过程，是保证人体正常发育、维持机体正常生理过程所必需的。在正常情况下，机体内细胞增殖与细胞凋亡保持着动态的平衡，但如果细胞凋亡及其调控基因发生异常打破了这种动态平衡，将导致多种疾病的发生，尤其会诱发肿瘤的发生【14】，近年来研究表明，许多抗肿瘤药物可通过诱导细胞凋亡来发挥治疗作用，肿瘤细胞凋亡敏感性可能是影响化疗效果的关键因素。因此能否诱导以及诱导凋亡的程度成为评价抗肿瘤药的重要指标之一【15】。
本实验通过AnnexinV-FITc流式细胞术检测人卵巢浆液性状囊腺癌SKOV3细胞凋亡定性分析的同时，测出活细胞、凋亡细胞、继发性坏死细胞和培养操作过程中出现机械损伤细胞的比例，与传统方法相比，更能直观、准确地反映细胞凋亡与药物作用的关系。凋亡分析显示：高浓度的E2 能够促进SKOV3细胞凋亡，此时雌激素受体抑制剂ICI 182 780具有对抗或减弱E2的促凋亡作用；低浓度（10-11mol/L、10-9mol/L）的E2对SKOV3细胞凋亡无明显影响（P
根据相关文献报道，目前认为雌激素对肿瘤细胞的作用机制主要包括：1、雌激素分子进入靶细胞核并与受体染色体DNA结合，影响基因的转录表达进而调节细胞的生理功能；2、雌激素是一种转录调节因子，其通过调节与细胞的生长控制或与癌细胞的转移浸润有关的靶基因起作用，如UO-44、fibinlin1、ezrin【18】 等；3、雌激素可以诱导卵巢癌细胞系表达肿瘤生长相关基因，如P53基因蛋白的过表达与较差的化疗反应有关【19】；4、雌激素可与细胞因子在卵巢癌细胞中交互调节，即雌激素可通过非受体转导通路，产生的放大信号通路促进卵巢癌的产生和发展【20】。这些可能是本实验中低浓度E2促进SKOV3细胞增殖的作用机制。
许多体外实验研究了雌激素对卵巢癌细胞增殖的作用，认为不同浓度的雌激素对卵巢癌细胞的增殖有着不同的效果，雌激素对癌细胞存在着剂量依赖效应【21】。李琮宾等【22】研究发现生理浓度范围的E2 对肿瘤细胞有着一定程度的促增殖作用，而高于10-7mol/L浓度的E2能够抑制卵巢癌3AO细胞的增殖，且有时间浓度依赖性；其认为，不同浓度E2 对肿瘤细胞的增殖的影响是通过不同的信号转导通路引起的，即当药物浓度达一定值时，可通过另外的通路机制影响细胞的增殖。
三、E2及ICI 182 780对人卵巢浆液性囊腺癌的临床应用价值
随着分子生物学技术的发展，研究发现，雌激素与多种恶性肿瘤的发生、发展及预后有关，如乳腺癌、子宫内膜癌等。近年来多项研究表明，雌激素与卵巢癌的发生和发展有着密切的关系，雌激素的作用是通过与其受体结合而实现的。ER有α和β两种亚型，雌激素通过ERα和ERβ在介导卵巢癌发生中起着重要作用，细胞内ERα亚型的表达会保护细胞免于凋亡的发生，ERβ对卵巢癌的作用与ERα相反，其通过直接调节某些特异的启动子或抗增殖能力的基因而抵抗ERα的作用，利于细胞凋亡的发生【23】。李琮宾【22】对卵巢癌3AO、H-8910、SKOV3细胞系进行ER亚型的PCR测定，结果显示：ERβ在此三系细胞中均有表达，但明显低于ERα， ERα在H-8910、SKOV3细胞中高表达，国内外多项体外实验提示，不同浓度的雌激素对不同类型的卵巢癌细胞增殖的影响是有差别的，这种差别决定着癌细胞的生与死以及其速率【24】。
近来临床研究表明，雌激素的使用增加了女性患卵巢癌的风险，亦会增强卵巢癌细胞迁移的倾向，即增加转移的机率。抗雌激素药物包括雌激素受体抑制剂和芳香化酶抑制剂。一直以来，他莫昔芬（雌激素受体抑制剂）是卵巢癌抗雌激素治疗的首选药物。一项Ⅱ期临床试验评价了联合他莫昔芬和吉非替尼（生长因子受体抑制剂）治疗卵巢癌，结果显示并没有改善卵巢癌患者的生存期【25】，目前仍缺少关于卵巢癌的抗雌激素治疗的大样本临床研究。ICI 182 780（氟维司群）作为一种雌激素受体特异性拮抗剂，不但阻断雌激素的促增殖效应，它本身也能抑制肿瘤细胞的生长，并且与雌激素有协同效应，引起的卵巢癌细胞的凋亡【26】。本文通过体外实验证实，生理浓度范围内E2具有促进细胞增殖的作用，而同浓度ICI 182 780可以抑制细胞增殖，且能够诱导并促进细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用，与他莫昔芬不同，ICI 182 780无雌激素样作用，已广泛应用于治疗乳腺癌。本实验为将来应用ICI 182 780辅助治疗卵巢癌提供一定的理论依据。雌激素受体及各细胞信号传导通路间的调控关系，尚有待于今后进一步的研究。
结论
（1）高浓度雌二醇对SKOV3细胞生长具有明显的抑制作用且具有促凋亡的作用；
（2）低浓度（近生理浓度）雌二醇对肿瘤细胞生长有促增殖的作用；
（3）雌激素受体抑制剂可对抗雌激素的作用，且可能有促进细胞凋亡的作用。
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致 谢
谨借本论文完成之际，向三年来给予我殷殷教诲、悉心指导的恩师石红教授致以崇高的敬意和衷心的感谢！导师严谨的工作作风、科学的思维方式、优秀的医疗技术、孜孜不倦的学习态度，犹如一盏明灯指引着我以后的工作道路。
衷心感谢妇产科全体医护人员，在临床实习工作中授予我的宝贵的临床经验和操作技能，在生活中给予的大力支持和无微不至的关怀。
衷心感谢大连医科大学附属一院中心实验室的老师们在实验过程中给予的耐心指导和细心帮助。
感谢所有关心、帮助我的老师和同学们！感谢我家人的理解、鼓励和支持！在我漫长的学习生涯中，他们是我前行的动力、力量的源泉，谨以此文献给他们！
细胞增殖论文范文第11篇
【摘要】
目的 探讨海洛因及嘌呤核苷酸对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖的影响。方法 体外培养大鼠 C6 神经胶质瘤细胞，分别以不同浓度的海洛因及嘌呤核苷酸处理细胞，MTT 比色法检测海洛因和嘌呤核苷酸对细胞增殖的影响。 结果 MTT 实验表明，海洛因对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖有抑制作用，120 mg/L海洛因作用 24 h对 C6 细胞的抑制率达 52%，并表现为剂量依赖性；嘌呤核苷酸对 C6 细胞的增殖有促进作用，120 mg/L嘌呤核苷酸作用 24 h，细胞增殖率为 30%，并表现为剂量依赖性。结论 海洛因抑制大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖；嘌呤核苷酸促进大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖，并在某种程度上对抗海洛因对 C6 细胞增殖的抑制作用。
【关键词】 嘌呤核苷酸；海洛因；神经胶质瘤细胞；细胞增殖。
【Abstract】Objective To investigate the effects of heroin and purine nucleotides on the proliferation of C6 glioma cells. Methods The effects of heroin and purine nucleotides on the proliferation of C6 glioma cells were evaluated by MTT assay. Results Heroin inhibited the growth of C6 glioma cells in vitro，52% C6 glioma cells were inhibited when the cells were treated with 120 mg/L heroin for 24 h；purine nucleotides promoted the proliferation of C6 glioma cells，30% C6 glioma cells were promoted when the cells were treated with 120 mg /L purine nucleotides for 24 h. Conclusions Heroin inhibits the proliferation of C6 glioma cells，purine nucleotides promotes the proliferation of C6 glioma cells.
【Key words】Purine nucleotides；Heroin；Glioma cells；Proliferation
由于大鼠 C6 神经胶质瘤细胞膜上存在阿片受体，目前已被广泛用作研究各种阿片类药物作用机制的模型系统〔1，2〕。本实验室研究发现，海洛因不但能够抑制大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖，而且还能使细胞内嘌呤核苷酸分解代谢增强〔3，4〕。已经明确的是海洛因对 C6 神经胶质瘤细胞的增殖有抑制作用，但是嘌呤核苷酸对经过海洛因处理过的大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖是否有影响并未见报道。本实验在前期研究发现的基础上，以大鼠 C6 神经胶质瘤细胞作为靶细胞，研究嘌呤核苷酸对海洛因处理的大鼠C6 神经胶质瘤细胞增殖的影响，探索嘌呤核苷酸治疗阿片类成瘾的潜在机制。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
C6 细胞株购自上海细胞研究所。低温台式离心机购自上海化工机械厂。倒置显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司。CO2培养箱购自日本 SANYO 公司。超净工作台购自苏州尚田洁净技术有限公司。DMEM培养基购自 Gibco公司，新生牛血清购自天津血液研究所。噻唑蓝 (MTT)、一磷酸腺苷 AMP 和一磷酸鸟苷 GMP购自Sigma公司。海洛因 (纯度为99% ) 由吉林省公安厅提供，临用时用灭菌三蒸水溶解。
1.2 大鼠 C6 神经胶质瘤细胞培养
C6 为贴壁生长的细胞。培养基为 DMEM，每100 ml培养基含青霉素 1 万U，链霉素10 mg，新生牛血清 15 ml，用灭菌的 5.6% NaHCO3 溶液调 pH7.2，置于 CO2 孵箱，37℃、5% CO2 条件下培养。细胞生长至近融合状态时，用 0.25% 胰酶消化传代，每周2～3次。
1.3 MTT 比色法检测海洛因对
C6 细胞增殖的影响及最佳药物剂量筛选 将处于对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化，用吸管将细胞吹打成单细胞悬液，血细胞计数板计数；将细胞以 1×104个/cm2 的浓度接种到 96 孔细胞培养板中，每组均设 3 个平行孔。以生理盐水作对照，加入海洛因使其终浓度分别为10、40、80 和 120 mg/L，37℃、5% CO2 培养箱中培养 24 h 后加入 20 μl浓度为 5 g/L的MTT，培养箱中继续培养 4 h；弃培养基，每孔加入 DMSO 200 μl，室温振荡 10 min 后，用酶标仪在波长 490 nm处测定吸光度值，计算细胞的生存率 (%) = (各实验组 OD 值/对照组 OD 值)×100%，绘制细胞生长曲线。
1.4 MTT 比色法测定嘌呤核苷酸对海洛因处理细胞增殖的影响
将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化，用吸管将细胞吹打成单细胞悬液，血球计数板计数；将细胞以1×104个/cm2的浓度接种到96孔细胞培养板中，每组均设3个平行孔。对照组为海洛因处理组，加入海洛因使其终浓度为120 mg/L；嘌呤核苷酸处理组在加入120 mg/L海洛因的同时，加入等摩尔混合的嘌呤核苷酸，使嘌呤核苷酸终浓度分别为10、40、80和120 mg/L，37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后加入20 μl浓度为 5 g/L 的MTT，培养箱中继续培养4 h；每孔加入 DMSO 200 μl，室温振荡10 min 后，用酶标仪在波长 490 nm处测定吸光度值，计算细胞生存率(%)=(各实验组OD值/对照组OD值)×100%，绘制细胞生长曲线。
1.5 统计学分析
用SPSS 13.0 统计分析软件进行方差齐性检验及成组设计资料 t检验。
2 结 果
2.1 海洛因对C6 细胞增殖的影响及最佳药物浓度
MTT 实验发现，低剂量 (10 mg/L) 的海洛因对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖的抑制作用并不明显，490 nm处吸光度值为1.393±0.084，其抑制率仅为 7%，与对照组(1.497±0.091)比较差异不显著 (P＞0.05)。当海洛因的浓度达到40 mg/L时，490 nm处吸光度值为0.967±0.097，对 C6 神经胶质瘤细胞增殖的抑制率为 35%；海洛因浓度为 80 mg/L 时，490 nm处吸光度值为0.777±0.067，抑制率为 48%；海洛因浓度为 120 mg/L 时，490 nm处吸光度值为0.713±0.068，抑制率为 52%；与对照组比较，差异均有显著性 (P＜0.05)。因此本文选择 120 mg/L的海洛因作为最佳药物剂量。
2.2 嘌呤核苷酸对海洛因处理的 C6 细胞增殖的影响
海洛因对照组490 nm处OD值为0.847±0.081，与海洛因组比较，嘌呤核苷酸的浓度为 10和 40 mg/L 时，490 nm处OD值分别为(0.573±0.077，0.803±0.098)，对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖的作用并不明显 (P＞0.05)。嘌呤核苷酸的浓度达到80 mg/L时，490 nm处OD值为1.037±0.059，细胞增殖率为 22%；嘌呤核苷酸的浓度为 120 mg/L时，490 nm处OD值为1.097±0.114，细胞增殖率为 30%；与海洛因组比较，差异均有显著性 (P＜0.05)。
3 讨 论
研究发现，海洛因能够抑制体外培养的大鼠神经元细胞增殖，其机制是海洛因诱导神经元细胞凋亡〔5〕。阿片类药物吗啡对去甲基丙咪嗪 (抗抑郁药) 和内皮素等药物处理后的大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖有抑制作用〔6〕。除此之外，本研究还发现，吗啡对没有经过任何药物处理的大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖也有抑制作用〔7〕。海洛因抑制大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖，其机制是海洛因使大鼠 C6 神经胶质瘤细胞中增殖细胞核抗原(PCNA) 表达减少 〔3，4〕。本实验通过 MTT 比色法也证实了海洛因浓度达到 40 mg/L 时，以剂量依赖的方式抑制大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖。同时，本实验通过 MTT 比色法证明，嘌呤核苷酸的浓度达到 80 mg/L时，以剂量依赖的方式促进大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖。这一结果表明，嘌呤核苷酸能够对抗海洛因对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖的抑制作用，其机制有待进一步探讨。
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细胞增殖论文范文第12篇
【摘要】目的 观察P27mt基因对宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用。方法 MTT法检测P27mt基因和放射线对Hela细胞的增殖抑制作用，绘制抑制率曲线图研究P27mt基因与放射联合应用时的作用特点；流式细胞法检测细胞周期和凋亡。结果 单纯照射对宫颈癌增殖有抑制作用，但有平台效应；P27mt基因对Hela细胞增殖具有明显的抑制作用，并呈时间和浓度依赖性；照射联用P27mt基因可进一步增强对宫颈癌的杀伤效应；单独照射和P27mt基因均能使细胞周期阻滞于放射敏感时相G2/M期，诱导细胞凋亡，联用效果更加显著。结论P27mt基因可通过阻滞细胞周期于G2/M期对宫颈癌Hela细胞产生放疗增敏作用。
宫颈癌是我国也是本地区最常见恶性肿瘤，放射治疗是重要治疗手段，目前多采用同步放化疗综合治疗模式，即通过同步应用小剂量化疗药物在不增加甚至降低射线剂量的基础上达到增强放射线对肿瘤细胞的杀伤作用[1] 。
p27 基因是细胞周期素依赖性激酶抑制因子（CDKI） 家族成员之一，是一类重要的细胞周期调控基因，可广泛抑制细胞周期素（ cyclin） 和细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK） 复合物的活性对细胞周期进行负性调控[2] 。Jean 等[3] 将p27 第187 位苏氨酸置换成丙氨酸（T187A） 转染HeyC2 细胞，发现细胞生长明显抑制，证实突变p27 （p27mt） 比野生型p27 抑制作用更强。p27mt对宫颈癌放疗作用如何未见有人报道，本文对此进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌Hela细胞株和p27mt 由湖北医药学院临床研究所惠赠； Clinac 600C/D加速器（ 美国Varian 公司）；流式细胞仪（美国Beckman Coluter公司）。
1.2 方法
1.2.1细胞培养 宫颈癌Hela细胞培养于含10%新生牛血清的1640中，并置于含5%C02的37℃孵箱中常规培养，每2-3d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2照射方法 在室温下采用6MV-X线照射，照射野10×10cm，剂量率40 cGy/min，源皮距为100cm，分别一次性给予各实验组6、8、10、12、14、16Gy剂量。
1.2.3放射线对Hela细胞增殖的影响 取对数生长期Hela细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，参照文献按辐射剂量分为6、8、10、12、14、16Gy共6组，每组设5个复孔，给予一次性射线照射12、24、48h后，每孔加入20μL MTT（5g/L），继续孵育4h，弃各孔液体，每孔加入150μL二甲基砜，低速震荡10min，酶标仪检测各孔在562nm波长处吸光度值，计算抑制率，求出辐射剂量坪值，即细胞增殖抑制率达最高的射线剂量。细胞抑制率=（1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值） ×100%。
1.2.4MTT法测定p27mt的辐射敏感性 取对数生长期细胞制成单细胞悬液，分为空白组、单药组、单放组、药放组。空白组只加细胞与培养液；单放组剂量取上述实验的坪值；单药组p27mt基因终浓度参照文献[4] 确定为10、20，30，40，50MOL（感染复数）共5组，药放组辐射剂量和药物浓度分别同单放组剂量和单药组浓度，共5组，每组设5个平行样本，测定各组吸光值后通过公式计算细胞抑制率。
1.2.5细胞周期分析及凋亡检测 细胞分组及处理同1.2.4，取处理完毕的4组细胞各1×106个， PBS洗2次，加入70%冷乙醇4℃固定过夜，清除固定液，加入PBS100μl混匀细胞，再加入10g/LRNAase2μl充分混匀，置37℃水浴锅中加温30min，加入碘化丙啶（PI）染色液（20μg/ml），常温避光30min后，流式细胞仪检测，Multicycle软件分析，拟合计算出细胞各时相百分比和凋亡率。
1.3统计学分析 所得数据以均数±标准差（x±s）的形式表示，SPSS17.0软件模拟生存曲线并进行单因素方差分析（两两比较采用S-N-K法），以P
2 结果
2.1 Hela细胞对射线照射的敏感性 射线照射对宫颈癌细胞增殖可产生明显的抑制作用，在射线剂量12Gy以内时，随着射线剂量的加大和照射后作用时间的延长，对细胞增殖的抑制率也明显增加，呈现出一定的量效和时效关系。在12Gy处出现坪值，故选用12Gy加药物进行后续的增敏实验。
2.2p27mt基因对Hela细胞增殖的影响 经不同浓度p27mt作用24、48、72h后，Hela细胞增殖均受到不同程度的抑制，并呈时间，浓度依赖性。各浓度姜黄素作用48h，细胞增殖抑制率在6%-78%之间，与对照组比较，20MOLp27mt基因即可产生有统计学差异的抑制作用（P
2.3p27mt基因对Hela细胞的放射增敏作用 选取12Gy剂量射线加不同浓度p27mt基因作用于Hela细胞结果显示出细胞增殖抑制率可进一步随药物浓度的增加而升高，当浓度大于40MOL时曲线趋于平坦。药物加辐射后，其24h细胞增殖抑制率均较单纯辐射或单纯药物组有统计学差异（P
2.4细胞周期分析及凋亡检测 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡结果表明，与空白组比较，单纯放射或药物均能提高G2/M期细胞比例，诱导细胞出现凋亡（P
3讨论
重组腺病毒作为一种高效基因转移载体被广泛用于将外源基因导入哺乳动物细胞，原因是腺病毒本身分子稳定，基因组不会发生重排，插入的外源基因也相当稳定，腺病毒允许插入的外源基因容量可达7.5Kb，不仅感染分裂期细胞，也可感染静止期细胞，感染率几乎100 % 。另外，它不与宿主基因组整合，没有基因毒性，比较安全。因此本研究拟通过腺病毒将突变型p27基因和X射线联合作用宫颈癌Hela细胞株模型，通过检测其放射敏感性及细胞周期及凋亡的改变，探讨p27基因放射增敏的作用及机制，为在临床上将突变型p27做为宫颈癌放疗增敏剂提供理论依据。研究结果显示，单纯应用p27mt，细胞增殖抑制率与药物浓度的增加成正比；单纯应用放射线照射，细胞抑制率也随射线剂量的增加而增加，但当辐射剂量达到12Gy时细胞增殖抑制率达到坪台期，不再随射线剂量的加大而增加。在此基础上，选用12Gy放射线联合不同浓度的p27mt做进一步的观察，结果显示，在单纯辐射剂量已达到“阈值”的情况下，联用p27mt仍可使细胞增殖抑制效果得到进一步的提高，且对细胞增殖的抑制率高于单纯放射组和单纯药物组（P
为初步探明增效机制，笔者进一步检测了p27mt同步放疗后对宫颈癌细胞凋亡和细胞周期的影响，结果发现，单独p27mt、单独射线均能对细胞产生诱导凋亡和G2/M期阻滞的作用，而联合应用后作用效果更为显著，这说明p27基因可能通过阻滞细胞周期于对G2/M期达到放疗增敏的作用。
参考文献
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细胞增殖论文范文第13篇
【关键词】 脂多糖；α干扰素；U937细胞；增殖；凋亡
作者单位：510800 南方医科大学附属花都医院肿瘤科 α干扰素(IFNα)能够显著抑制肿瘤细胞的增殖，能够增加NK细胞和其他一些活性免疫细胞功能，有较强的抗肿瘤活性，其发挥抗肿瘤作用的机制是通过直接抑制肿瘤细胞的增殖与分化，目前IFNα在临床上已被广泛用于血液系统肿瘤的治疗［1］。Toll样受体为介导天然免疫反应并触发或桥接适应性免疫的模式识别的一类受体，这类受体在U937细胞中表达。作为Toll样受体的主要外源性配体之一的内毒素脂多糖(LPS)，可与Toll样受体结合后通过信号转导的级联效应产生抑制U937的增殖［2］。本文旨在研究LPS在体外是否具有增强IFNα抑制白血病细胞株U937细胞增殖效应和机制。为TLR配体或其激动剂协同佐剂IFNα免疫治疗白血病提供理论依据。
1 材料与方法
11 材料 胎牛血清(FBS)(天津市灏洋生物制品科技责任有限公司，批号：100413)；二甲亚砜(DMSO)溶液、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(北京SABC公司产品)；EL301型酶标仪(美国BioTek公司)；人白血病细胞株U937细胞自购进后复苏使用。
12 方法
121 U937细胞增殖抑制率的测定 人白血病细胞株U937细胞常规离心弃上清复苏，复苏后的细胞在加热灭活的10%FBS及100 μg/ml链霉素、100 Μ/ml青霉素的RPMI1640的培养基中，置于37℃、湿度饱和及5%的CO2孵箱中培养，平均每3天对培养基进行更换并传代一次。依据处理U937细胞的药物不同对实验进行分组，实验组：A组(单用IFNα 01 μg/ml)、B组(单用LPS 01 μg/ml)，C组(两药等剂量合用)；另设空白对照组。经药物处理后的U937细胞，混匀后，移取100 μl至96孔培养板中，细胞浓度约为5×105 ml，每组重复8孔，最终每孔体积为02 ml。置37℃、湿度饱和及5%的CO2孵箱中培养；培养液3 d更换一次。于培养终止前4 h每孔中加入20 μL MTT(5 mg/ml)，4 h后离心(3 000 rpm?min，5 min)，将上清弃去，然后每孔加入DMSO 150 μL以终止培养。使用酶联免疫检测仪测定其吸光度，以此计算细胞增殖抑制率〔细胞增殖抑制率(%)=(l实验组吸光度/对照组吸光度)×100%〕。
122 U937细胞凋亡率的检测 100 μL人白血病细胞株U937细胞置于含10%FBS的RPMI1640培养基中培养过夜，细胞密度调节至5×106/ml，Binding缓冲液洗涤一次，另取100 μL Binding缓冲液重悬，移取5 μL AnnexinVFITC加入，置暗处孵育20 min，移取10 μL浓度为1 mg/ml的AnnexinV/碘化丙锭，室温下暗处孵育20 min，Binding缓冲液洗涤后重悬，立即检测，获取参数并进行数据分析。
13 统计学方法 所有数据录入Excel中初步处理后，采用SPSS 170统计学软件包进行数据处理，计量资料以均值±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，以P
2 结果
各组给予不同药物与U937细胞作用2 d后，与对照组比较，各实验组的抑制率(%)和凋亡率(%)均显著升高(P
表1 IFNα和/或LPS对U937细胞增值的抑制率和
细胞凋亡率的影响(x±s)
组别 抑制率(%) 凋亡率(%)
A组 041±005* 036±003*
实验组 B组 033±001* 030±002*
C组 072±006*# 063±005*#
对照组 006±002 007±004
注：*与对照组比，各实验组均有统计学意义(P
3 讨论
急性白血病的发生和发展比较复杂，具有多阶段、多步骤、多基因的特点。IFNα抗肿瘤的活性较强，临床上已广泛应用于恶性血液系统肿瘤治疗并有较好疗效［3］。其发挥抗肿瘤的效应的主要机制是调节细胞免疫活性或抑制肿瘤细胞的增殖［4］。LPS为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要组成成分，其对应的受体是Toll样受体8，通过激动或抑制该受体在白血病细胞株U937的表达而达到干预的作用［5］。本实验结果显示，IFNα或LPS对U937细胞的增殖率和凋亡率均有明显的升高作用，而等剂量合用后这一作用显著增强。为佐剂IFNα联合Toll样受体配体或其激动剂免疫治疗白血病提供了新的思路。
参 考 文 献
［1］ 熊芳, 王兴兵, 张佳华, 等 Toll样受体在U937细胞的表达及其作用研究.中国实验血液学杂志, 2007, 15(3): 449452.
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［3］ 王晓桃, 林文远, 陈蓓莉, 等 α干扰素联合脂多糖对白血病细胞株U937细胞周期的影响及其机制研究. 中国全科医学, 2011, 14(10 c): 34573459.
细胞增殖论文范文第14篇
【摘要】目的：探讨在促小鼠成肌细胞增殖过程中，胰岛素对PI3K/Akt/p70S6K1信号传导通路的作用。方法：以小鼠成肌细胞C2C12为研究对象，利用蛋白免疫印迹（western blot）和MTT方法检测Akt蛋白激酶的表达和细胞增殖变化。结果（1）胰岛素（100-200 nM）浓度依赖性地促进C2C12细胞的增殖，胰岛素干预C2C12细胞，引起Akt/p70S6K1的磷酸化；（2）PI3K抑制剂LY294002能浓度依赖地抑制胰岛素引起的Akt磷酸化和细胞增殖；（3）p70S6K1抑制剂―雷帕霉素（rapamycin） 浓度依赖地抑制胰岛素引起的p70S6K1磷酸化和细胞增殖。结论：胰岛素促进小鼠C2C12成肌细胞的增殖。胰岛素能激活C2C12细胞的Akt/p70S6K1信号通路，并且这种激活是胰岛素促进的C2C12细胞增殖所必需的。
【关键词】胰岛素；C2C12细胞；Akt/p70S6K1的磷酸化；雷帕霉素
InsulinpromoteC2C12 myoblast proliferation viaPI3K/Akt/p70S6K1
Mei Aihong1 Yan Zhengmao1 Zhang Guoliang1 Wu Guoting2
【Abstract】Objective: To explore the effectof insulin in on the signaling pathway of PI3K/Akt/p70S6K1 related to the myoblasts proliferation of rats.Methods:, western blotwasperformed to detect the protein expression in cultured mouse C2C12 myoblasts.Results: （1） Insulin （100-200 nM） can stimulateC2C12 myoblasts proliferation with a dose dependent manner andpromotethe phosphorylation of Akt/p70S6K1. （2） PI3K inhibitor of LY294002 can inhibit insulin-induced Akt phosphorylation and cell proliferation with a concentration dependent manner. （3） p70S6K1 inhibitor of rapamycin can inhibit insulin-induced p70S6K1 phosphorylation and cell proliferation with a concentration relationship . Conclusion:. Insulin can stimulate C2C12 myoblast proliferation andthisactivation of Akt/p70S6K1 signaling pathway is necessary for insulin-induced C2C12 myoblast proliferation.
【Key works】Insulin; C2C12; myoblasts;phosphorylation of Akt/p70S6K1;rapamycin
【中图分类号】R711.4【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2011）06-0273-03
骨骼肌损伤后的再生过程包括，骨骼肌前体细胞（卫星细胞）的增殖和分化，以及多个卫星细胞融合成肌管参与骨伤肌的修复［1］。以往的研究证实，胰岛素能促进小鼠成肌细胞DNA和蛋白质的合成，增加PCNA（Proliferating Cell Nuclear Antigen,增殖细胞核抗原和cyclin D1（细胞周期蛋白D1）蛋白的表达，促进细胞从G1期向G2/M期转变，在骨骼肌前体细胞的增殖和分化中起重要作用［2］。
尽管在很多细胞中，已有对胰岛素或胰岛素样生长因子-1的促细胞增殖信号通路的研究，但在骨骼肌细胞，对胰岛素调控细胞增殖的信号通路的研究还不多。已有的研究证实，MAPK信号通路参与了胰岛素样生长因子-1促进的骨骼肌细胞的增殖［3］；在胰岛素促进的细胞增殖中，PI3K和MAPK信号通路都参与了该过程。但是, 哪些PI3K下游因子参与胰岛素促进的骨骼肌细胞增殖目前还不十分清楚。p70S6K1是PI3K/Akt通路的重要下游因子，它是一种蛋白激酶，是细胞生长、增殖的关键性调控因子，它能够磷酸化核糖体40S小亚基蛋白S6，而磷酸化的S6蛋白能促进蛋白质翻译起始［1，3］。已有研究报道p70S6K1能调控蛋白质的合成［4, 5］。
C2C12成肌细胞是一种来源于小鼠卫星细胞的细胞株，是广泛地用于研究骨骼肌生长和分化的体外模型。因此，我们以小鼠成肌细胞C2C12为对象，研究胰岛素是否通过激活PI3K/Akt/p70S6K1信号通路，促进成肌细胞的增值。
1 材料和方法
1.1 试剂和溶液配制:胰岛素, LY294002，雷帕霉素（rapamycin）和四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自Sigma公司（St Louis，MO, USA）。磷酸化Akt（Ser-473）抗体，Akt抗体, 磷酸化p70S6K1抗体购自细胞信号技术公司（Cell Signaling Technology ，Beverly, MA, USA）。p70S6K1抗体购自Santa Cruz 生物技术公司（Biotechnology,Santa Cruz, CA, USA）。DMEM购于Invitrogen公司（Carlsbad, CA, USA）。胎牛血清购自Hyclone公司（logan, UT, USA）。
LY294002和雷帕霉素（rapamycin） 溶于二甲基亚砜（dimetheyl sulphoxide），储存于-20℃；胰岛素溶于水配制成100μM母液，分装储存于-20℃；MTT的配制：thiazolyl blue tetrazolium bromide 溴化噻唑蓝四氮唑（即前述的四甲基偶氮唑蓝MTT）（M5655） 以PBS配制成5mg/ml贮存液，0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃避光保存。
1.2 细胞培养:C2C12细胞购自中国科学院上海科学院研究院细胞库。C2C12细胞接种于含有10%胎牛血清的培养基DMEM （内含4.5g/L 葡萄糖（glucose）， 4 mM 谷氨酸（glutamine），100U/ml青霉素和100mg/L链霉素）中， ,置于37℃5%CO2的培养箱中培养。当细胞长到80%-90%时，按1:2-3的比例传代。传代时先用PBS漂洗细胞一遍后，用胰酶消化3min，加入与胰酶相等体积的完全培养液中止消化，再将细胞轻轻吹打下来，于新的细胞培养皿中传代。
1.3 免疫印记:当C2C12细胞生长至80%融合时，用无血清的培养液处理12-16小时，加入胰岛素（终浓度200 nM）处理相应的时间后，收集细胞用于免疫印记检测［6］。具体的步骤为：弃去细胞上层培养液，用冰冷的PBS润洗一遍，用细胞刮子收集细胞于1.5ml离心管中，6000rpm4 ℃离心5分钟，弃去上清，加入含有各种蛋白酶抑制剂（1 mM sodium vanadate（正钒酸钠）, 1 mM leupeptin（亮肽素）, 1 mM aprotinin（抑肽酶）, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride（PMSF，苯甲基磺酰氯化物，）, 1 mM dithiothreitol（DTT，二硫苏糖醇）, 和1 mM pepstatin A（胃酶抑素A））的RIPA 缓冲液（100 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Triton, 1% deoxycholic acid, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 2 mM NaF），旋涡混匀，冰上放置30min，4 ℃12000rpm离心10min，取上清用Bio-Rad公司的Lowry 试剂盒测定总蛋白浓度，用96孔板中进行测定，操作按说明书进行。根据所测蛋白浓度，计算出各样品取相同上样量所需体积，进行免疫印迹实验，所选变性聚丙烯酰胺凝胶分离胶浓度为7%-10%。将样品与2×SDS上样缓冲液混合，于100℃煮沸5min后上样。恒压100V电泳，时间至样品染料指示剂至胶的下端。用湿转法100V 恒压转膜90分钟。然后，用丽春红染膜1-2min观察条带。用PBS/T洗膜2次，每次5min，用5%脱脂奶粉（PBS/T配制）封闭1小时，加入一抗4℃过夜。用洗膜液洗涤3次，每次5min，加入二抗作用1小时，再用洗膜液洗涤3次，每次10min。用ECL溶液（PE公司）进行发光反应，操作按照说明书进行。
1.4 细胞增殖实验:细胞增殖实验用MTT法检测［7］。取100 μl细胞悬液（约5000个细胞）于96孔板中，用血清培养液培养24小时，加入胰岛素（200 nM）作用 20小时，加入MTT溶液20 μl （5 mg/ml）孵育4小时，吸去上层液体，加入200 μl DMSO溶解紫色结晶，用分光光度计测量570 nm的吸光度。
1.5 统计学分析:数据用平均值±标准误表示，当两组间比较时用非配对t检验，多组间比较时用单因素方差分析进行统计学分析，P
2 结果
2.1 胰岛素对C2C12细胞的增殖作用: 为明确胰岛素是否刺激C2C12细胞的增殖，用胰岛素处理细胞，MTT法检测细胞的增殖，结果表明胰岛素能浓度依赖性地增加C2C12细胞的增殖（如图1）。
Figure 1. Serum-starved C2C12 cells were cultured in the presence or absence of insulin （100 or 200 nM） for 24 hours. The MTT assay was performed as described in the Methods. Values are mean±SE from three replicate experiments. * and ** indicates significantly different when compared to the control （*P
2.2 胰岛素对C2C12细胞Akt的激活: Akt是一种蛋白激酶，是细胞生长、增殖的关键性调控因子。如图2A所示，胰岛素作用C2C12细胞30分钟，Akt能被胰岛素激活。为了研究PI3K/Akt信号通路在胰岛素促进的C2C12细胞增殖中的作用，用 PI3K抑制剂LY294002作用细胞，发现它能浓度依赖地抑制胰岛素引起的Akt磷酸化（如图2A），提示PI3K是Akt的上游分子。进一步研究发现LY294002浓度依赖地抑制胰岛素引起的细胞增殖（如图2B），表明PI3K/Akt信号通路的激活参与了胰岛素引起的C2C12细胞的增殖。
Figure 2. （A） Serum-starved C2C12 cells were pretreated with or without LY294002 （10 or 20 μM） for 30 min, then in the presence or absence of insulin （100 nM） for 30 min. Immunoblotting analysis was performed using the antibodies against phospho-Akt and Akt. （B） Serum-starved cells were cultured in the presence or absence of LY294002 （10, 20 μM）, followed by the treatment with insulin （100 nM） for 24 hours. MTT assays were performed. Values are the mean±SE from three replicate experiments.** indicates significantly different compared to the control （P
2.3 胰岛素对C2C12细胞p70S6K1的激活:p70S6K1是PI3K/Akt信号通路的重要下游分子，为了研究p70S6K1在胰岛素刺激的C2C12细胞增殖中的作用，用不同浓度的mTOR/p70S6K1的专一性抑制剂――雷帕霉素（rapamycin）处理细胞，发现该抑制剂对胰岛素激活的p70S6K1有浓度依赖性的抑制作用（如图3A），胰岛素刺激的C2C12细胞增殖也被rapamycin明显抑制（如图3B），这说明p70S6K1的激活在胰岛素诱导的C2C12细胞增殖中起重要作用，是细胞增殖所必需的。
Figure 3. （A） Serum-starved C2C12 cells were pretreated with or without rapamycin （10 or 20 nM） for 30 min, then in the presence or absence of insulin （100 nM） for 2 hours. Immunoblotting analysis was performed using the antibodies against phospho-p70S6K1 and p70S6K1. （B） Serum-starved cells were cultured in the presence or absence of rapamycin （10 or 20 nM）, followed by the treatment with insulin （100 nM） for 24 hours. MTT assays were performed. Values are the mean±SE from three replicate experiments.** indicates significantly different compared to the control （P
3 讨论
研究表明，一些生长因子通过跨膜信号转导激活PI3K激酶，使AKT磷酸化，AKT再直接磷酸化mTOR［8, 9］。mTOR蛋白是一种多功能激酶，是细胞增殖、蛋白质合成和细胞周期进程的关键性调节子。mTOR的下游效应器主要包括核糖体S6激酶（p70S6K）、翻译起始 因 子 eIF4E 和 eIF4G1 、 翻 译 延 长 因 子 eEF2 及 翻 译 抑 制 蛋 白4E-BPs。P70S6K是一种核糖体蛋白激酶，被mTOR在Thr389或Thr404磷酸化后激活，而磷酸化40S核糖体S6蛋白，控制着含有5’-TOP结构的mRNA的翻译，这些mRNA编码的主要是白体蛋白和翻译延长因子，因此非常重要［10-12］。
在本研究中，发现胰岛素促进小鼠成肌细胞的增殖，AKT/p70S6K1信号通路的激活参与了胰岛素引起的成肌细胞的增殖。以往研究证实［2］，在小鼠成肌细胞C2C12中，胰岛素受体高表达，在10nM胰岛素的作用下，胰岛素受体即自身磷酸化。尽管在C2C12细胞中IRS-1, IRS-2和Shc蛋白均表达，但在胰岛素的作用下只有IRS-1蛋白高度磷酸化。IRS-1蛋白磷酸化后与PI3K激酶的p85亚基结合，进而激活下游的信号分子。在本研究中，发现胰岛素激活小鼠成肌细胞AKT和p70S6K1信号分子（图2A和3A），尽管并没有证实是否AKT是p70S6K1的上游分子，但以往的研究证实在L6肌管细胞中过表达的AKT可促进胰岛素刺激的p70S6K1激酶的激活［13］，提示AKT是p70S6K1的上游分子。本文对培养的C2C12细胞无血清培养处理后，再加入胰岛素或相应的信号通路的化学抑制剂，以观察哪些信号通路参与了细胞的增殖，发现PI3K/ p70S6K1通路是胰岛素刺激的细胞增殖所必须的，因为LY294002（PI3K, AKT的抑制剂）和rapamycin（p70S6K1的抑制剂）能完全抑制胰岛素促进的细胞增殖（图2B和3B）。这表明p70S6K1激酶的激活在骨骼肌细胞的增殖中起很重要的作用。
因此，该体外研究结果表明，以p70S6K1激酶为靶位点，激活该激酶的药物或因子，将有助于骨骼肌细胞的生长，这为这类药物的进一步体内研究提供了一定的理论基础。
参考文献
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细胞增殖论文范文第15篇
【关键词】 姜黄素 肿瘤，鳞状细胞 细胞凋亡
【摘要】
目的 探讨姜黄素对人口腔鳞癌细胞tca8113及tb增殖的抑制及诱导凋亡作用。方法 分别应用6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/l的姜黄素作用tca8113及tb细胞24 h，采用mtt法检测姜黄素对口腔鳞癌细胞tca8113及tb增殖的抑制作用，形态学观察及流式细胞仪测定细胞凋亡。结果 6.25～50.00 μmol/l姜黄素能显著抑制口腔鳞癌细胞tca8113和tb细胞的增殖（f=793.94、391.08,q=6.00～62.68，p<0.05)。流式细胞仪检测显示口腔鳞癌细胞凋亡率随姜黄素浓度升高而增加。倒置显微镜下可观察到部分凋亡细胞出现染色质凝集、核固缩、核碎裂等形态学改变。结论 姜黄素对人口腔鳞癌细胞tca8113及tb的增殖具有显著的抑制作用，并可诱导细胞凋亡。
【关键词】 姜黄素 肿瘤，鳞状细胞 细胞凋亡
effects of curcumin on proliferation and apoptosis of human oral squamous cell carcinoma
pang baoxing, jin xiaoming, zhang xiaoyan
(department of stomatology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china);
［abstract］ objective to investigate the inhibition and apoptosisinducing effects of curcumin on tca8113 and tb cells of human oral squamous cell carcinoma. methods tca8113 and tb cells were treated with different concentrations of curcumin(6.25, 12.50, 25.00, and 50.00 μmol/l), respectively, for 24 hours. mtt was used to determine the inhibition of curcumin. morphological assay and flow cytometry were employed to detect the apoptosis. results the proliferation of tca8113 and tb cells were significantly inhibited by curcumin at all concentations applied (f=793.94,391.08;q=6.00-62.68;p<0.05). the results of flow cytometry demonstrated the apoptosis rate increased gradually along with the increase of concentrations of curcumin. morphological changes including chromatic agglutination, karyopyknosis, and nuclear fragmentation could be observed in some of the cells under inverted microscope. conclusion curcumin can notably inhibit proliferation and induce apoptosis of tca8113 and tb cells of human oral squamous cell carcinoma.
［key words］ curcumin; neoplasms, squamous cell; apoptosis
姜黄素是从中药姜黄中提取的一种酚类物质，它具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等作用，特别是其抗肿瘤的作用日益为人们所关注。国内外众多学者对姜黄素的抗肿瘤作用做了大量的研究，结果证实姜黄素具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用[1]。本实验通过研究姜黄素对人口腔鳞癌细胞tca8113及tb增殖的抑制及诱导凋亡作用，为口腔鳞癌的治疗提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
人舌鳞癌细胞系tca8113及其脑转移亚系tb由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室提供。姜黄素(sigma公司) 以dmso配成50 mmol/l储备液，置于-20 ℃冰箱保存，实验时以培养液稀释成实验浓度。rpmi 1640培养液(gibco公司), 胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(mtt，美国sigma公司)，二甲基亚砜(dmso，美国sigma公司)，倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司），酶标仪（奥地利tecan公司），流式细胞仪（美国bd公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
tca8113及tb细胞生长于含体积分数0.10胎牛血清的rpmi 1640培养液中，置于37 ℃、体积分数0.05 co2、饱和湿度的co2细胞培养箱内，倒置显微镜下观察细胞生长状态。
1.2.2 姜黄素对tca8113及tb细胞增殖的影响将细胞以5×107/l接种到96孔培养板内, 待细胞贴壁后分别加入终浓度为6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/l的姜黄素，对照组仅加入rpmi 1640培养液，每种浓度均设5个复孔，分别孵育24 h。每组在实验终止前4 h加入10 μl mtt, 弃培养液，每孔加入100 μl dmso，震荡10 min，酶标仪测定570 nm波长处吸光度（a）值，并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(1－实验组a值均数／对照组a值均数)×100%。
1.2.3 fcm检测细胞凋亡
将细胞以1×108/l接种到6孔培养板内，待细胞贴壁后分别加入终浓度为6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/l的姜黄素, 孵育24 h,收集各组细胞, pbs清洗离心，体积分数0.70冷乙醇固定细胞，上机前加含rna酶的pi染液，4 ℃避光30 min后上机检测。
1.3 统计学处理
应用spss 11.5及ppms 1.5[2]统计软件进行数据处理，各指标比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验。
2 结果
2.1 tca8113及tb细胞形态学变化
倒置显微镜下，对照组细胞贴壁生长，细胞呈梭形或多角形，胞浆丰富，生长旺盛，相邻细胞生长融合成片。加入不同浓度的姜黄素后，随着浓度的增加和作用时间的延长，tca8113及tb细胞开始变小、变圆，折光性增强，细胞贴壁性降低，呈现典型的凋亡形态，镜下可见染色质凝集、核固缩、核碎裂等形态学改变（图1、2）。
2.2 姜黄素对tca8113及tb细胞增殖的影响
对照组tca8113及tb细胞体外生长活跃，经6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/l的姜黄素处理24 h后，两种细胞的生长均呈现不同程度的抑制，并且呈剂量依赖性。不同浓度姜黄素处理tca8113细胞及tb细胞，其增殖抑制率的差异均有显著意义(f=793.94、391.08,q=6.00～62.68，p<0.05)。见表1。表1 不同浓度姜黄素对tca8113及tb细胞增殖抑制率的影响（略）
2.3 姜黄素作用后tca8113及tb细胞凋亡情况
6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/l的姜黄素分别作用于tca8113及tb细胞24 h后，其亚二倍体凋亡峰随药物浓度增加而逐渐增高，凋亡率呈现明显的上升趋势，表明姜黄素可以诱导tca8113及tb细胞的凋亡（图3）。
3 讨 论
口腔鳞状细胞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，近年来发病率有增高趋势，预后较差[3]。目前使用的传统化疗药物多为细胞毒性药物,副作用较大,并且许多病人对其不敏感,严重影响了口腔鳞状细胞癌的治疗效果。因此，研究和开发新的抗肿瘤药物有着极其重要的意义。
从天然药物中提取有效成分用于治疗恶性肿瘤已经获得了广泛的应用，并成为国内外医药工作者关注的一个热点。姜黄素是中药姜黄的一种活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、清除自由基、抗微生物以及对心血管系统、消化系统等多方面药理作用，尤其姜黄素的抗肿瘤作用日益引起人们重视[4]。国内外众多学者对姜黄素的抗肿瘤作用及其机制做了大量研究，证实姜黄素具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的确切作用，然而有关其抗口腔鳞状细胞癌的研究却少见报道。
本研究采用人舌鳞癌细胞系tca8113及其脑转移亚系tb作为研究对象，舌癌脑转移细胞系tb是吴军正等[5]在裸鼠体内实验中获得的人舌癌细胞系脑转移特例，并运用细胞培养技术建株，不仅具有舌癌细胞tca8113所具有的特性，而且更易增殖、复发及转移。本文结果显示，姜黄素对tca8113及tb细胞的增殖抑制作用显著。此外，细胞形态学观察和流式细胞术检测表明，姜黄素以剂量依赖性方式增加亚二倍体凋亡峰，发挥诱导细胞凋亡作用。这些结果与aggarwal等[6]对包括mda1986在内的多种头颈鳞癌细胞研究结果相一致。同时本文结果还显示，姜黄素对舌癌脑转移细胞系tb的增殖抑制作用优于tca8113，我们推测，姜黄素对口腔鳞癌高转移细胞系相关信号转导通路调控幅度较大是其可能的原因之一。
近年来，姜黄素作为一种植物来源的、低副作用的药物在肿瘤治疗方面研究极受重视，细胞实验和动物实验均证明姜黄素具有确切的抗肿瘤作用，如能对其作用机制和构效关系进行深入研究，将有望应用于口腔鳞状细胞癌的治疗和化学预防。
【参考文献】
[1]kunnumakkara a b, anand p, aggarwal b b. curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins[j]. cancer lett, 2008,269(2):199225.
[2]周晓彬,纪新强,徐莉. ppms 1.5统计软件的功能及其应用[j]. 青岛大学医学院学报， 2009,45(1):92.
[3]raybauddiogène h, tétu b, morency r, et al. p53 overexpression in head and neck squamous cell carcinoma: review of the literature[j]. eur j cancer b oral oncol, 1996,32b(3):143149.
[4]anand p, sundaram c, jhurani s, et al. curcumin and cancer: an “oldage” disease with an “ageold” solution[j]. cancer lett, 2008,267(1):133164.
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