环境激素与冷应激对勃起功能障碍研究范文

摘要:目的模拟环境雌激素与冷应激建立复合应激勃起功能障碍（ED）大鼠模型。方法从120只正常雄性大鼠中随机抽取20只为正常组（N组），余100只为建模组（M组）。采用环境雌激素样饮食联合冷应激干预条件建立复合应激大鼠模型，定期观察大鼠生物学体征、行为学变化，并检测应激相关指标，建模24周后，通过阿朴吗啡（APO）勃起和交配实验筛选出ED大鼠模型（ED组），未成ED者为复合应激模型组（S组）。检测各组大鼠血清肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）、睪酮（T）、雌二醇（E2）、糖皮质激素（GC）、TNF-α、IL-1β和IL-17α表达水平。结果（1）M组较N组大鼠体质量增长显著减缓，差异具统计学意义（P＜0.05）；在中心区活动时间和进入中心区次数显著减少，差异具统计学意义（P＜0.05）；血清E水平稍有上升，但差异无统计学意义（P＞0.05），NE水平显著上升、GC水平显著下降，差异均具统计学意义（P＜0.05）；阴茎勃起、交配和射精次数显著减少，差异具统计学意义（P＜0.05）；（2）ED组较N组和S组大鼠血清E2水平稍升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），T水平显著下降，差异具统计学意义（P＜0.05）；血清E、NE水平显著上升，GC水平显著下降，差异均具统计学意义（P＜0.05）；血清TNF-α、IL-1β和IL-17α水平显著上升，差异均具统计学意义（P＜0.05）。结论环境雌激素样饮食联合冷应激可成功建立复合应激ED大鼠模型，并为复合应激性ED的基础与应用研究提供了良好的模型。

关键词:雌激素类;应激;勃起功能障碍

勃起功能障碍（erectiledysfuction,ED）是指阴茎持续（至少6个月）不能达到和维持充分的勃起以获得满意的性生活[1]。据文献报道，全球约有1亿多ED患者，40~70岁的男性中，约有52%的男性有不同程度的ED，更因生活节奏加快、工作压力变大及环境污染因素其发病率呈明显上升趋势[2]。目前针对糖尿病、高脂血症和神经损伤等因素引发的ED基础研究相对较多，但就环境应激、环境雌激素对勃起功能影响领域的研究相对较少，尤其是针对复合因素诱导的ED研究，相关ED动物模型则更是鲜有报道。故本研究，通过模拟环境雌激素与冷应激建立慢性复合应激大鼠模型，通过勃起功能和交配实验成功筛选出ED大鼠模型。并通过观测生物学体征、行为模式和性功能改变、应激相关指标变化，对此模型进行了系统评价，现报道如下。

资料与方法

一、资料

（一）实验动物取120只正常雄性SD大鼠（6周龄），20只性成熟雌性大鼠（2月龄），体质量（200±10）g，购自新疆医科大学实验动物中心。

（二）主要实验仪器RXZ-436LD型人工气候箱（宁波江南仪器厂），酶标仪（美国BioRad公司）。

（三）主要试剂和药物阿朴吗啡（apomorphine，APO，A4393-250MG，Sigma，美国）；黄体酮（120804，浙江仙琚治药股份有限公司）；雌二醇（E2，B130613，宁波市三生药业有限公司）；大鼠TNF-αELISA试剂盒（货号0707170709，RayBio，美国）、大鼠IL-1βELISA试剂盒（货号0707170721，RayBio，美国）；大鼠IL-17αELISA试剂盒（货号ab214028，abcam，美国）；大鼠糖皮质激素（GC）ELISA试剂盒（货号BPE30607，Lengton，中国）；大鼠睪酮（T）放免试剂盒、大鼠雌二醇（E2）放免试剂盒、大鼠肾上腺素（E）放免试剂盒与大鼠去甲肾上腺素（NE）放免试剂盒均购自北京北方生物所；戊巴比妥纳（货号57-33-0，Sigma，美国）厂家；酒精、氯化钠等常规试剂及耗材均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

二、方法

（一）环境雌激素样饲料的制备按每1kg大鼠常规饲料中加入芫荽籽和菠菜籽各150g，饲料由新疆医科大学实验动物中心提供。

（二）发情雌鼠的制备按照文献[3]进行发情雌鼠的制备。

（三）应激大鼠模型的建立与ED模型的筛选取120只经勃起实验和交配实验证实具有正常性功能的雄性SD大鼠，随机取20只为正常对照组（N组），余100只为建模组（M组）。大鼠行1周适应性饲养后进入实验，N组大鼠于常规环境中饲养[温度（20±2）℃，湿度55%~65%]，每日给300g普通饲料。M组置于人工气候箱中[温度（7±2）℃，湿度85%~95%]饲养，每日给环境雌激素样饲料300g。动态观测生物学体征与行为模式改变，评价应激模型成模情况，并观测交配能力与勃起功能改变。建模24周时，M组大鼠通过APO阴茎勃起实验和交配实验筛选出ED大鼠模型（ED组），未成ED者为复合应激组（S组）。

（四）APO阴茎勃起实验和交配实验根据文献[3]进行APO阴茎勃起实验和交配实验。

（五）旷场实验将大鼠分别放入一规格为100cm×100cm×50cm的医用有机板观察箱中（XR-XZ301，上海欣软信息科技有限公司），四壁光照强度为200lx。摄像机记 录大鼠的运动轨迹及状态，Noldus（Noldus，美国）软件分析大鼠在中心区活动时间及进入中心区的次数。

（六）血清指标检测在新疆医科大学第一附属医院核医学放免试验室，根据放免试试盒说明书，对大鼠血精中T、E2、E和NE水平进行检测。根据ELISA试剂盒说明书，对大鼠血清中GC、TNF-α、IL-1β和IL-17α进行水平检测。

三、统计学分析

采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料用以x±s表示，多组数据做正态检验和方差齐性检验，满足条件，采用单因素方差分析（ANOVA），如不满足条件，求出秩次进行方差分析，检验水准α=0.05。P＜0.05有统计学差异。

结果

一、应激大鼠体质量的变化

结果显示，在建模第8周、16周和24周，M组大鼠体质量和体质量增长率均显著低于N组（P＜0.05，见表1）。

二、应激大鼠行为学变化

与N组比较，M组大鼠倦卧少动，在中心区活动时间和进入中心区的次数减少，差异有统计学意义（表2，P＜0.05）。三、应激大鼠E、NE和GC水平变化由表3可见，与N组比较，M组大鼠血清中E水平升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；NE水平升高，GC水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

四、应激大鼠勃起功能与交配能力的变化

结果显示，第8周、第16周和第24周，M组大鼠阴茎勃起次数、插入次数和射精次数均低于N组，差异均有统计学意义（P＜0.05，见表4、表5），且随着造模时间延长，呈减少趋势。

五、ED大鼠血清E、NE和GC水平的变化

由表6可见，与N组相比，S组大鼠E和GC水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与N组和S组相比，ED组NE水平上升，GC水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

六、ED大鼠血清T和E2变化

由表7可见，与N组比较，S组大鼠血清中T水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），E2水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与N组和S组相比，ED组大鼠血清中T水平降低，E2水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

七、ED大鼠血清中IL-17α、IL-1β和TNF-α水平变化

由表8可见，与N组比较，S组和ED组大鼠血清中IL-17α、IL-1β和TNF-α表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与S组相比，ED组大鼠血清中IL-17α、IL-1β和TNF-α表达变化无统计学意义（P＞0.05）。

讨论

ED属于男性常见疾病，对男性生理和心理影响极大。随着生活方式的改变，男性工作压力大、饮食结构改变，多喜空调制冷环境和冰箱制冷食物，导致ED发病率逐年上升。有文献报道[4]，预计2025年，全球ED患病人数将达到3.22亿。流行病学调查显示与ED发病有关的因素包括糖尿病、心血管疾病、肥胖、泌尿系统疾病和精神疾病等[4]，该领域的基础与临床应用研究也得到较为深入的开展，但是，关于环境激素和冷刺激对男性ED影响的研究较少。本研究，模拟环境激素联合冷应激的干预条件，观察其对性行为能力和阴茎勃起功能的影响，探索了复合应激ED大鼠模型建立的可行性。作为对应激模型的评价，一般从3个方面进行：（1）行为学上表现出焦虑样行为，同时体质量增长缓慢；（2）下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）激活，E、NE和皮质醇水平升高；（3）慢性炎症水平显著升高[5]。本研究结果显示，在环境雌激素样饮食联合冷应激条件的干预下，M组大鼠在建模过程中，早期呈现急躁易怒等行为学改变，肾上腺轴和交感神经兴奋，但随着时间的推移，出现倦卧少动、毛发无光等变化，体质量增长较N组显著减缓。旷场实验中M组大鼠在中心区活动时间和进入中心区次数显著减少。该结果显示，本方法建立的复合应激模型和复合应激ED大鼠模型组从行为学改变上，均符合应激模型的标准。本研究还发现M组大鼠E水平明显升高，NE水平较N组显著性升高，而GC水平显著下降，提示雌激素样饮食联合冷应激能显著升高大鼠应激水平。但关于GC水平显著下降可能和长期冷暴露后对HPA轴激素水平的影响有关[6]。另一实验结果显示，S组和ED组大鼠外周血中TNF-α、IL-1β和IL-17α水平均显著上升，这可能和慢性应激能损伤机体的免疫系统，导致血液中炎症因子显著上升，同时可见GC水平下调，而炎症因子水平上调，该结果与国内外研究结果[7,8]得出的结论一致，亦可能与上述应激条件的长期刺激有关。本研究中性行为学与阴茎勃起功能检测结果显示，在雌激素样饮食联合冷应激的干预下，大鼠出现应激改变的同时，性行为和阴茎勃起功能显著减退，并随造模时间的延长，进一步加重，至干预24周时，共有57只大鼠出现ED，成模率达56.7%。ED组大鼠血清中NE与GC水平均较N组具有显著性差异，并和S组之间亦具有显著性差异，提示其不仅与应激相关，同时也参与到了应激性ED的发生与发展中。本研究还发现TNF-α、IL-1β和IL-17α等炎症因子在ED的发生发展中可能也发挥着重要的作用，其机制可能与血管事件有着密切联系[9]。进一步研究发现，S组和ED组大鼠T表达均显著降低，且ED组大鼠T水平显著低于S组，而E2在ED组的表达较N组和S组显著升高。这可能与雌激素样饮食联合冷应激通过影响T的分泌有关，也可能和制作雌激素样饲料的菠菜籽、芫荽籽分别富含异黄酮、雌二醇、雌三醇等植物雌激素[10,11]，进而导致雌激素的雄激素抵抗作用有关[12,13]，并促进ED的发生。综上所述，运用雌激素样饮食联合冷应激复合干预法能够建立慢性复合应激大鼠模型，该模型从体质量、行为学、肾上腺轴变化及炎症反应均具备了应激模型的特征，从中筛选出的ED模型有良好的科学性，并具有ED成模率高的特点；同时，该方法较好地模拟了环境复合应激因素对性行为能力和阴茎勃起功能损伤并导致ED发生的慢性病理过程，为研究环境雌激素和冷应激在ED的发生发展中的作用机制及相关药物的筛选与研究提供了良好的动物模型。ED的致病因素固然很多，本研究模拟临床，通过环境雌激素与冷应激构建复合因素基础上探讨了复合应激型ED的动物模型，具有重要的科学意义，下一步将就环境激素与冷刺激在ED中的独立致病机制作为研究的重点。

参考文献

3张盼盼,王丽,阿地力江•伊明,等.雌性大鼠交配实验模型的建立.中国男科学杂志2014;(6):6-9

5于泽谋,王萌,陈坤,等.高脂血症新西兰大白兔慢性应激模型的建立及评价.中华医学杂志2017;(7):529-534

7黄樾.内源性肾上腺GC对血管炎症反应抑制作用的研究.广州:广州医科大学医学院,2009

10李小梅,张丽茁,张景涛.芫荽营养与药理作用研究.黑龙江农业科学2010;(3):121-123

11吴开莉,吕华伟,颜继忠.菠菜中化学成分及药理活性研究进展.食品与药品2016;8(3):222-227

作者：刘凤霞  斯依提阿木提 阿卜杜热伊木江如则 薛志琴 张盼盼 马文静 毛吾兰买买提依明 蒋萍 阿地力江伊明 单位：新疆医科大学基础医学院