干细胞培养技术范文
干细胞培养技术范文第1篇
关键词：植物；干细胞；培养；生长特性
中图分类号：R282.2／R282.71 文献标识码：A 文章编号：1672-979X(2012)01-0052-04
植物来源的天然产物作为先导化合物和药物的主要来源，曾在制药业的发展中发挥过非常重要的作用。近年其地位日渐衰落，主要是因天然植物生长缓慢、活性成分含量低，致使此类化合物的来源难以保障，难以适应现代制药业工业化大生产的需求。
鉴于天然化合物具有重要的药用潜力和经济价值，随着现代科学的发展，各领域的学者为解决其来源给出了自己的答案，较有成效的研究主要集中在以下几方面：(1)在微生物中表达天然产物的合成途径，采用转基因工程菌发酵方式生产某些活性成分，如紫杉醇等；(2)以容易获得的化工原料或天然前体为基础，半合成某些结构复杂的化合物，例如：青蒿素等；(3)植物组织培养，定向生产目标成分，如紫草素等。然而，由于很多天然产物化学结构非常复杂和独特，涉及的生物合成途径也非常多，例如紫杉醇(20步反应)、喜树碱(11步反应)、长春新碱(18步反应)等化合物的生物合成均涉及一系列繁杂的酶促反应，要化学合成需要多达数十步反应。这样的天然产物在很长一段时间内是难以依靠化学合成或者合成途径表达的方法实现原料供应的。而植物培养技术，以生源植物细胞或组织固有的生物合成途径为基础，利用内源的相关酶系统，结合诱导子和生物反应器技术，定向生产目标成分，经过多年研究，已经有成功工业化的案例(表1)。如日本Mitsui Petrochemical Industries采用人工培养紫草细胞方法获得紫草素，实现了该成分的工业化生产。所得的紫草素不仅用以生产抗炎药，制成唇膏，在本国高科技绿色产品的概念推动下，当年销售量达到200万支，获得了良好的市场效益。美国Phyton Biotech公司利用红豆杉细胞培养技术，结合大量的诱导子实验，创立了紫杉醇高产的方法，其专利中披露的最高产量达902 mg／L。该公司目前已经获得FDA批准，以此专利技术为施贵宝公司供应紫杉醇。
1.植物培养技术面临的挑战
尽管已有许多成功的案例，植物培养技术在适应工业化生产过程中，仍要面临着很多问题需要解决。(1)很多活性成分在生源植物中的分布，呈现组织特异性。某些特定的组织培养物(如：茎、根、芽、毛状根等)，可以表现出与生源植物类似的代谢产物谱，但脱分化细胞中的二次代谢产物丰度非常低，甚至根本没有。例如：喜树碱在脱分化细胞中含量非常低，或者根本检测不到，但在喜树的根培养物中，其含量则与原植物不相上下。与此类似的是，在黄花蒿的脱分化细胞中，也没能检测到其抗疟成分――青蒿素。虽然，培养特定组织容易获得较高产率，但是，该类培养物在常用的生物反应器中难以生长，甚至不能存活，需要开发定制特殊的反应器，难以适应现阶段工业化生产的需要。脱分化细胞在该方面具有明显的优势，能够很好的适应商业化生产的需要。因此，如何提高脱分化细胞中目标成分的含量及产量，已成为目前植物组织培养研究的热点。现阶段采用的方法有：细胞系优选、培养条件优化、诱导子的使用、前体饲喂、阶段培养、灌注培养、细胞固定化等。根据具体情况选择不同的方法，可以获得较理想的结果。(2)植物细胞长期培养时，由于细胞不均一、基因突变、环境因素影响等原因，其生理、生化以及遗传性状逐渐发生变化，成为其商业化的另一大障碍。含量低和易变性作为植物细胞培养商业化的两大阻碍。迄今的研究多集中在前者上，经过多年努力，已建立了一系列卓有成效的实验技术和解决方案。相对而言，控制可变性的研究尚处于较浅水平，鲜有确实可行的方法。近年，在长期培养的细胞系中，随着培养时间延长，代谢产物含量普遍降低，使研究者日益关注植物细胞培养中可变性的机制以及控制方法。由于植物的种间差异和多样性，使此问题异常复杂，传统的研究方法和角度难以对此问题做出全面解答。由韩国和英国学者开发的植物干细胞培养技术，利用干细胞生长和遗传特性方面的优势，为解决上述问题提供了一个全新的方案。
2.植物干细胞培养基本方法
2010年11月，韩国Unhwa公司和英国爱丁堡大学的研究者将以红豆杉干细胞培养为主体的研究成果，以“Cultured cambial meristematic cells as a source of plantnatural products”为题在Nature的子刊Nature Biotechnology上发表。该刊同期还发表了对此成果进行报道评论的综述“Plant natural products from cultured multipotentcells”。以红豆杉体系为代表的植物干细胞培养技术，吸引了全世界的关注。
植物干细胞培养技术，是在传统组培技术的基础上，改进了现有方法，以植物干细胞为目标，诱导、分离和培养外植体，建立相应的干细胞培养体系。植物干细胞培养技术，不仅丰富了植物培养技术，而且为天然产物的商业化生产，乃至植物生物技术的发展，提供了新的研究方向和契机。
根据目标干细胞的不同，目前较为成功的植物干细胞培养方法主要有以下几种。
木本植物维管形成层分生(以红豆杉为例)：采取野生红豆杉的新生枝条，表面灭菌后切开；将含有形成层、韧皮部、皮质和表皮的组织轻轻地从木质部剥离；将获得的组织在分离培养基上培养30d后，新生的形成层细胞和其他脱分化细胞(愈伤组织)因组织现状的差异自然分离――形成层细胞为均一生长的平板状组织，愈伤组织则为不规则的聚集生长物；将获得形成层细胞转移到生长培养基上培养。目前报道该方法成功的案例仅限于红豆杉属。
草本植物储藏根的维管形成层(以人参为例)：取户外培育、平滑无伤口的人参，表面灭菌；将主根削成薄片，再切成长5～7 mm，宽5～7 mm，高2～5 mm，使每片都含有形成层；将制备好的外植体用蔗糖高渗透液处理，使分化的组织――皮层、韧皮部、木质部、髓部等失去活力，仅形成层能保留生命力；将渗透液处理过的的外植体转移到诱导培养基，培养3-7 d后，外植体的形成层变成淡黄色；再过7～14 d后，淡黄色部分有一圈细胞生长出；将外植体继代到生长培养基，培养10-20 d后，即可分离得形成层细胞，所得细胞继续在同样的培养基上培养。目前，仅有人参属确实报道成功建立了该类干细胞培养体系。
静止中心(以水稻为例)：将稻谷剥皮，表面灭菌，干燥至水分完全去除；将干种子种入培养基，25℃下培养5 d，使其发芽；种子发芽5-6 d后，收集含有静止中心的根组织，去掉根端的根冠，从切口开始截取1 mm长作为外植体；将外植体放入诱导培养基，30 d后观察到细胞被
诱导出：所得静止中心干细胞为白色，均一，且周围环绕着黏性物质(黏原蛋白)，而一般根组织得到的细胞不均一，黄色，无黏性物质，这些差异使干细胞可以和其它细胞自然分离；将分离得到的静止中心干细胞转移到生长培养基。目前，利用该方法可以获得水稻、玉米等植物的干细胞培养体系。
3.植物干细胞培养体系的特性研究
不同来源的植物干细胞培养体系，有着不同的生长特性(表2)，这些特性决定了其各自的用途。这些方法由韩国Unhwa公司开发，现已申请了一系列相关专利。
所有的研究中，考察红豆杉干细胞培养体系的生长特性最为深入和全面。在完成了培养体系的初步建立工作后，研究者首先考察了获得细胞的形态、遗传学特征和基因组学方面的考察，以验证培养的细胞确为维管形成层细胞。另一方面，对培养体系的生长特性进行了研究，主要考察了细胞生长速度、长期培养稳定性(时长22个月)以及对生物反应器的适应性，并与脱分化得到的愈伤组织进行对比。红豆杉干细胞培养体系不仅生长速度快，性状稳定，而且由于细胞具有游离生长、液泡分散的特性，培养体系对各种类型(气升式、搅拌桨式)、各种规格(3L、10L、20L、3吨)的生物反应器均具有良好的适应性，具备了商业化生产的基本条件。为开发培养体系的实用价值，研究者诱导了所得培养体系活性成分，使其中紫杉醇含量提高了数十倍，并进一步进行灌注培养，促使更多的紫杉醇分泌到培养基中[含量268 mg／kg(细胞鲜重)，分泌率74％]。此外，研究者还系列测试了红豆杉干细胞提取物的抗癌活性，在抑制HHC-95肺癌细胞、PC-3前列腺癌等瘤株的实验中，提取物均显示了可与紫杉醇媲美的抗癌效果(该实验所用的培养体系未经诱导，经检测基本不含紫杉醇)。以上工作，从各方面为该技术的商业化提供了有力的技术支持。
对于水稻等干细胞的研究，主要目的是建立植物细胞银行。建立细胞银行可使植物细胞采用类似动物细胞冻存一复苏的培养方法，彻底解决植物细胞培养过程中的变异问题。该策略虽简单可行，但是一般的植物细胞却难以在冻存后顺利复苏，其存活率非常低，且回复生长能力的延迟期漫长。因此，该方面的研究一直停滞不前。如表2所示，以上各种干细胞的一个共同特征就是可在冻存条件下保持良好的生命力，这使植物细胞银行的建立具备了良好的前提。此外，植物干细胞培养体系建立方法的多样性使该技术具有普遍推广的潜力，因而可以预见，植物细胞银行中能够容纳的植物种类将非常丰富。作者相信，随着植物细胞银行的建立，不仅可以为植物细胞培养的稳定性提供一个切实有效的解决方法，而且将在植物种质资源的保存方面发挥关键作用。
目前，人参干细胞的研究成果，主要用于保健品和化妆品的开发，除了相关专利和文章外，已有相关产品面世。相信在植物干细胞这个高科技和全天然概念推动下，该类产品将会很快地在高端市场占有一席之地。
4.植物干细胞培养体系的应用展望
干细胞培养技术范文第2篇
细胞工程课程在生物科学专业的设置
本课程自从2007年在我校新办生物技术专业开设以来，根据学校对本科生物技术专业的培养计划，细胞工程是生物技术专业的主干课程，并于2009－2010学年第二学期开始开设。通过对该课程的教学，使学生掌握细胞工程所涉及的基本概念、原理、技术方法、应用基础等内容。通过近三年的教学实践，不断加强课程建设与发展，理论教学体系已经基本完善，实验教学平台基本建立。通过全面进行教学改革，已逐渐形成本校建设的特色课程。21世纪，生命科学全面快速发展。根据学科发展和社会需求趋势，在新办生物技术专业基础之上，2009年我校新办生物科学专业。然而，新办生物科学专业的困境是专业范围宽泛;如何在有限的时间内，全面、高效地培养适应社会需求的合格人才，是每位任课教师和教学管理者必须认清的首要问题。为了充分发挥我们医学院校的资源优势，在培养学生方向定位上，以健康教育为主要方向，兼顾生物制药等，但又与生物技术的培养方式不同。由于细胞工程是由细胞生物学、分子生物学、基因工程、工程学等学科理论技术有机结合的一门崭新学科，因而被设定为新办生物科学专业本科生培养计划的必修课程。
细胞工程课程在生物科学中的开设，是以普通生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、分子生物学、微生物学、免疫学等先修课程为基础。同时，将本课程的学习与基因工程、生物技术等课程的学习互相补充和相互促进，为将来从事生命科学基础理论研究、生物制品的开发和应用、疾病诊断技术的开发与应用等领域的工作打下必要的基础。在教材方面，以李志勇编著《细胞工程》(高等教育出版社)为基本教材，以杨吉成编著《细胞工程》(化学工业出版社)、安利国编著《细胞工程》(第二版，科学出版社)等为主要参考教材。在教师队伍配置方面，既有细胞生物学领域教学经验丰富的教授，也有年富力强的专业知识扎实的中青年骨干教师。细胞工程的理论教学和实验教学全部由既具有扎实生物工程学相关知识背景，又有基础细胞理论与实验技术背景的骨干教师承担。
细胞工程教学内容的设定与改革
细胞工程课程的特色，是以细胞工程技术方法的基本原理为课程教学切入点。在教学内容上，基本理论的讲授与技术方法过程的介绍并重;在本学科知识的系统性方面，既有本学科理论的系统性，又加强与其他相关学科的相互渗透交叉，尤其是以细胞生物学、生物工程的基础知识背景，为本学科的理论教学奠定基础;通过将现有技术的原理、应用归纳，与本学科相关技术的发展趋势讲解相结合;从内容上，客观系统地反映本学科相关领域应用前景、重点研究方向和尚待解决的科学问题;在理论上自成体系。根据教学计划，细胞工程在我校总学时设定为80学时，其中理论50学时，实验30学时。本课程的开设，一般在第三学年的第二学期，在普通生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、组织胚胎学等课程修完之后进行。细胞工程在教学内容、教学方法上又与以上学科大不相同，本课程教学是以技术方法的原理为基础理论的学科，因此实验与理论教学并重。细胞工程课程的理论课程内容，根据研究对象一般分为三大部分内容，分别为:细胞工程概论与基本技术、植物细胞工程、动物细胞工程。根据我校的教学实际情况和培养计划，我们对教学内容进行了适当的改革与调整。课程的内容重点在第一部分细胞工程概论与基本技术和第三部分动物细胞工程［1－4］。
干细胞培养技术范文第3篇
结合有丝分裂的内容，引导学生看课本插图P117图6-8红细胞和心肌细胞、P117图6-9各种植物细胞、P117图6-10分化的细胞可形成不同的组织和器官。
在学生看图的过程中展示图1。
引出细胞分化的概念，得出细胞分化的意义。
在个体发育中，相同细胞的后代，在形态、结构和功能上发生稳定性差异的过程。细胞分化是生物个体发育的基础。细胞分化过程中遗传物质没有变化，是基因选择性表达的结果。需要提醒的是细胞分化贯穿在整个生命周期中，不只出现在胚胎时期，为干细胞做铺垫。
分析得出细胞分化的特点：普遍性、持久性、稳定性、不可逆性。
接着，引导学生比较细胞分化与细胞分裂的区别。
通过对插图和表格的分析，使学生分清了细胞分化与细胞分裂的区别；了解了细胞分化的过程和特点；知道了细胞分化的生物学意义。
二、利用科学发展史了解科学的发展，正确看待科学技术对社会的影响
1.从科学发展史中学习科学与技术的关系
结合课本插图P118图6-12植物组织培养过程。通过对植物组织培养研究的历史发展过程的分析来总结科学发展的历史经验并揭示其规律。
1902年德国植物学家哈伯兰特（Haberlandt）提出细胞全能性概念，并用叶肉和其他多种细胞进行离体培养。在自制的营养物质中培养，仅出现一些细胞增大，未出现增殖和分化现象。
1934年荷兰植物学家（温特）F.W.Went发现了吲哚乙酸（IAA），随后又有人相继发现了IBA，NAA和2.4-D人工合成的生长素。
1934年怀特（White）用无机盐、糖类和酵母提取物配制成怀特培养基，用番茄根进行离体培养形成愈伤组织。其后证明了生长素和维生素对组培的作用，提出了细胞全能性学说。
20世纪40-50年代，斯库格（Skoog）和崔等人利用添加了腺嘌呤和生长素的培养基进行烟草培养，诱导根、芽等器官，并确定腺嘌呤和生长素诱导根和芽生长的作用。
1958年美国斯图尔德（Steward）等和德国赖纳（Reinert）等分别将培养的胡萝卜根细胞诱导形成了胚状体，形成新植株。用实验证明了植物细胞的全能性。
从以上植物细胞全能性的研究历史，我们可知培养基是影响成功的重要的因素，正是因为科学和技术的相互支持，才使组织培养技术能够获得成功和完善。
通过植物组织培养，我们可以获得大量的克隆体，保持优良特性，缩短生产周期。为我们的生活提供丰富的物质保障，如花卉和蔬菜培育。
2.科学与技术对社会的影响
植物细胞的全能性，引发了人们对于动物细胞是否具有全能性的猜想，经过许多科学家的努力，动物细胞的体外培育不能实现细胞的全能性。几经周折后，科学家终于通过细胞重组技术证明出了动物细胞核具全能性。因为细胞核具有生物体的绝大部分遗传物质。
证明动物细胞核具全能性的就是克隆技术，也称核移植。
1996年7月5日，世界上第一只克隆羊多利（Dolly）由英国爱丁堡大学的伊恩・维尔穆特博士培育成功，但这成功并不是利用一个细胞就实验成功了，而是利用了上千个卵细胞才成功一个，其中过程也是很复杂的，是科学理论的指导下进行的。
克隆可以用于造福人类，比如说治疗性克隆，利用胚胎干细胞进行器官移植。要是被别有用心的人利用，克隆也可以影响人类的正常秩序，那后果将不堪设想。比如说克隆优等人种组成军队统治世界。
所以，科学是技术发展的理论基础，技术是科学发展的手段。科学技术是社会进步的动力，然而科学技术的也会给人类带来负效应，应正确处理好科学技术和社会的关系。
三、与现实生活的联系，进行STS教育
本节课有个探究模块，就是干细胞的知识。课标要求学生能自主搜集资料，并与同学分享成果。通过查找资料让学生及时理解关注对科学、技术和社会发展具有重大影响的生物学新进展，激发学生学习生物学的积极性。
学生分享：移植弟弟脐带血治好血癌，3岁女童健康成长；姚明加入中华骨髓库等案例。
引导学生通过讨论得出：白血病就是骨髓中的造血干细胞在分化的过程当中出现问题，导致不能正常增殖、分化出血红细胞。我们可以用正常的造血干细胞替代有问题的细胞，达到治疗的目的。脐带血里含有造血干细胞，通过移植造血干细胞就可以慢慢恢复造血功能。
干细胞可以分为三大类：全能干细胞、多能干细胞，专能干细胞
这里的脐带血就是专能干细胞，可以分化成红细胞、白细胞等各类血细胞。
引导到目前人类遇到的重大科学难题――器官移植。器官移植需要先配型，后移植，移植成功后还需要终生服用抗免疫排斥的药。有没有能绕过免疫排斥的方法呢？那就是利用自身的干细胞培育出所需要的器官移植是最好的选择，它不会产生免疫排斥反应。
干细胞培育的方法还有望用于拯救珍稀、濒危动物。适当的介绍干细胞新进展，诱导多功能干细胞（iPS）的研究在生物和医学领域具有广阔的应用前景，有望成为实施再生医学和细胞治疗的重要细胞来源。
上述实例的介绍，让学生深刻体会到科学与技术对社会的影响力，从而激发学生强烈的好奇心和学习生物科学的兴趣。
四、课堂教学渗透STS教育的效果
我们将STS教育思想实施在具体教学的过程中，概念性的知识可以通过插图、绘图等手段，使学生更容易理解、掌握；技术性的知识通过科学发展史的学习，了解科学发展对人类的生活的作用，进而对科学萌生浓厚的兴趣；对于科学前沿知识应充分发挥学生的动手能力，查找相关的知识，讨论得出结果，再结合社会实际和学生的生活经验事例，将学习联系到现实生活中来，从而对内容进行加深巩固。
干细胞培养技术范文第4篇
什么是CAL活细胞移植技术？
CAL的英文全称为Cell-assisted lipotransfer，即细胞辅助脂肪移植技术。这个名字的提出者是日本杏林大学整形外科教授、日本东京医科大学整形外科主任吉村浩太郎（KotaroYo-shimura）。他于2008年，成功从自体脂肪中提取出了SVF （Stromal vascular fraction）细胞，并将它混入到将要移植的自体脂肪中，再注入体内，大大提高了脂肪的成活率，而SVF细胞中最有效的成分就是脂肪干细胞。所以CAL活细胞移植就是将未经体外培养的，从新鲜脂肪中提取出的含有脂肪干细胞的细胞群（其中脂肪干细胞占35%左右），注入自体脂肪移植中，增加其干细胞含量的一种技术。
他所做的CAL活细胞移植，在自体脂肪移植的同时提取脂肪干细胞，再移植回体内，未经过体外培养以及任何外界干预，所以是非常安全的。就如同自体成分输血一样，抽出血液，提取某种成分后，就马上输回体内，也是很安全的。由此，我们可以看到这项技术本身是没有问题的，可被国内的某些机构拿来后，就成了商家的噱头，并加入了体外培养的环节，“送至研发中心进行技术处理，对自身活细胞进行细胞活性分析、活细胞比例分析、临床最佳活细胞配比分析”，貌似很先进，其实很危险。
细胞体外培养风险大
人体生长发育依靠的就是细胞的分裂繁殖，为了确保每个细胞分裂良好，人体有一套严密的免疫和防御系统，如果人体内细胞在分裂过程中形成不良细胞，淋巴系统和巨噬细胞就会将它吞噬，不会让它继续生长阻碍身体发展。
经体外培养的细胞，容易受外界环境的影响导致变异或者染色体异常，形成许多不良细胞，当这些不良细胞被注射进人体后，就可能形成肿瘤，危及人的生命安全。而新闻中报道的女孩，正是由于注入了经体外培养的不良细胞而导致两侧形成肿块的。
我国卫生部早就出台《干细胞临床试验研究管理办法》，对干细胞的临床试验都有一整套申报、备案及监管流程，明确禁止经过体外培养的干细胞医疗技术应用于临床治疗，可有些医疗机构却充耳不闻，为赚取高额利润，置消费者健康于不顾。
体外培养干细胞用于临床的要求非常高，需要符合生物药品的一整套技术准入要求，对培养环境、仪器设备、人员、试剂、流程、质量控制等都有严格控制，目前即使在国际上，经政府批准的体外培养干细胞临床试验总共也只有32个，只停留在试验阶段，根本不可能进入临床应用。
脂肪干细胞在自体脂肪移植中的重要作用
整形机构之所以能把CAL活细胞移植作为噱头来吸引客户，就在于脂肪干细胞在自体脂肪移植中确实发挥着异乎寻常的重要作用。
脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，即ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。
研究发现脂肪干细胞在体外稳定衰亡率低，同时它具有取材容易的优点，所以很适宜自体移植。
原先传统的自体脂肪移植最大的缺陷就是自体脂肪成活率不高，容易被吸收，究其原因，也是因为移植脂肪中的干细胞含量大大降低，只有人体正常含量的一半左右。
脂肪干细胞能促进脂肪中新生血管的形成，为植入的脂肪细胞提供了必要的营养，同时干细胞也可向脂肪细胞分化，所以大大提高了自体脂肪的成活率。
最后，提醒广大求美者，自体脂肪移植是项复杂精细的手术，从吸脂环节开始就要减少损伤，才能最大限度的保存脂肪细胞活性，加入的脂肪干细胞才能促进脂肪细胞成活。在脂肪处理环节，也要尽可能多的增加脂肪干细胞含量，而最重要的是注射环节，必须做到均匀、少量、分层注射，如果注射成团，会导致内结节、肿块形成、钙化等并发症。无论在哪个环节出问题，都会影响手术效果，所以美国整形外科医师协会建议，自体脂肪移植慎用于隆乳，因为手术效果主要取决于医师的技术和经验。
李发成 医学博士、主任医师、教授、硕士生导师，现任中国医学科学院整形外科医院国贸门诊部主任。兼任北京市整形美容业协会常务理事、北京医疗整形美容质量控制和改进中心医疗专家组委员、医疗美容主诊医师培训与考试专家委员会委员。
干细胞培养技术范文第5篇
【关键词】造血干细胞；体外扩增；3D支架
【Abstract】Hematopoietic stem cells （HSCs） have both self-renewal and differentiation potential and could be differentiated into blood and immune systems. 3 d scaffolds can simulate the bone marrow microenvironment in vivo， therefore， here is to make a review on the 3D scaffold Advances in the Expansion of Hematopoietic Stem Cells in vitro.
【Key words】Hematopoietic stem cells； Ex vivo expansion； 3D scaffold
造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，也可以说它是一切血细胞的原始细胞。造血干细胞移植技术已得到全世界的认可，并成为根治白血病等疾病的主要手段，为人类战胜疾病带来新的希望。造血干细胞体外扩增具有重要的临床和高端科研意义，造血干细胞体外扩增培养可以保证有足够多的细胞数量供于患者造血干细胞移植，同时也是一项极具挑战的技术。
1 造血干细胞
造血干细胞的来源主要包括骨髓、外周血和脐带血。骨髓中造血干细胞含量高，但从骨髓中获取造血干细胞需要通过骨髓穿刺技术，对供者的伤害较大。经过 G-CSF 动员后的外周血造血干细胞比例增加，成为现在临床上造血干细胞移植最重要的来源[1]。脐带血造血干细胞含量丰富，且异体排斥反应小，免疫原性低，再生能力强，但其总体体积小，仅适用体重较轻的儿童患者，很难满足对于成人造血干细胞移植的需要[2]。因此，科学家在体外有效扩增造血干细胞方面做了很大努力。
造血干细胞具有2个重要的特征：高度的自我更新或自我复制能力，是一种多能干细胞[3]。造血干细胞移植可治疗恶性血液病，部分恶性肿瘤，部分遗传性疾病等75种致死性疾病[4]。
2 3D支架在造血干细胞体外扩增中的应用
研究表明3D培养对于提高干细胞的体外扩增倍数，延长体外培养时间和维持的自我更新能力有显著效果。3D支架培养能很好的模拟造血干细胞微环境的三维组织结构。细胞在支架上的生长、移植和内生长率直接依赖于支架的多孔结构、孔隙率、孔的直径和孔的形状。目前，三维培养支架材料有天然材料和合成材料两大类。
2.1 天然材料支架
天然支架材料主要有胶原蛋白、透明质酸类等ECM成分。ECM成分在细胞的粘附、存活、增殖、分化及干性维持中发挥着重要的作用。天然的ECM主要是从组织脱细胞提取或者培养细胞合成分泌获得。
胶原蛋白支架： Isabelle Leisten等[5]以8份体积的酸性胶原和1份体积的10×DMEM培养基混合后，以2M NaOH中和溶液；再分别加入1份体积的间充质干细胞培养基或含间充质干细胞的培养基，所得悬浮液转移至24孔板内，在37℃条件下孵育1h，获得无细胞或含间充质干细胞的胶原凝胶，造血干细胞单一培养、骨髓间充质干细胞或脐血间充质干细胞共培养。在细胞培养过程中，除了使用传统的液体培养体系，还采用了2种3D龛模型对比，龛I为造血干细胞悬浮于胶原凝胶上方；龛II为造血干细胞迁移至胶原酶I消化处理的胶原凝胶内。龛I条件下细胞增殖，且含造血干细胞（CD34+/CD38-）、老化髓细胞（CD38+、CD13+、CAE+）和NK细胞（CD56+）等多种细胞，龛II条件下造血干细胞有较高水平的原始CD34+/CD38-表型和髓系分化（CD13+、CAE+），类似于骨髓龛的骨内膜部位，而脐血间充质干细胞共培养体系不适于造血干细胞扩增。所以说，胶原蛋白和骨髓间充质干细胞的基质支持体系可有效成功地扩增造血干细胞，为研究造血作用的机制如增殖、分化、凋亡和间质改变提供了良好的模型，也可以作为血液疾病的药物筛选平台。
透明质酸水凝胶支架： 透明质酸水凝胶由透明质酸和ADH交联物长链和EDCI组成，制备方法为：透明质酸和ADH交联物溶解于去离子水中，PH调至4.6，加入碳二亚胺试剂（EDCI）水溶液，轻轻搅动2h形成凝胶；以0.1N NaCl盐析2天形成透明质酸水凝胶，再分别置于25%乙醇溶液和去离子水内放置2天去除未反应的ADH和EDCI；制备的凝胶于冻干器内冻干，冻干品于-20℃保存，使用前加热灭菌处理。透明质酸水凝胶支架可在不添加额外细胞因子的条件下培养和扩增造血干细胞，体外扩增28天的克隆形成率为传统培养法的280倍。以Pronectin F Plus？R包被和非包被的透明质酸水凝胶支架对造血干细胞扩增无明显差别[6]。
纤维蛋白支架： Ferreira MS等[7]在无菌条件下，混凝血酶、人凝血蛋白原自制悬浮液（由纤维蛋白原、CaCl2、GBSH5缓冲液组成），于37℃条件下聚合反应20min，得到所需的3D纤维蛋白支架。该支架孔径2-50μm，纤维直径0.3μm，支架直径6500μm，高2000μm，细胞生长体积为67mm3。支架无菌处理后置于96孔板中，接种脐血间充质干细胞和造血干细胞的重悬液。与3D PLGA meshes、3D InsertTM-PCL和3D OptiMaixTM-collagen 三种支架相比，新制备的3D纤维蛋白支架培养体系细胞增殖最高，培养14天的总有核细胞扩增了5×108倍，培养7天的CD34+细胞扩增了3×107倍；分裂细胞原始免疫表型更高；形态学、迁移和黏附性能更优；骨髓、脾脏和血液长期移植的NSG小鼠体内实验中也表现出最强的移植和多向分化能力。因此，该支架为脐血扩增和移植临床应用的最佳选择。
细胞制备的无细胞支架： MS-5细胞以去离子水孵育2～3min使细胞贴壁状态松弛，0.02M NH4OH室温孵育1～2min促进细胞裂解。基质干燥过夜，储存于PBS液中，4℃保存，得到所需生物支架[8]，成功用于脐血造血干细胞的扩增。
藻酸盐支架：袁燕等[9]将脐血单核细胞重悬于1.1%藻酸盐或1.1%藻酸盐-0.1%明胶溶液，混匀后通过27-g针头逐滴加入100mM氯化钙溶液中，旋转6～10min使形成的固态微球硬化成型；然后转移至培养皿中即为三维静止培养体系。该体系能在降低生长因子用量的同时有效地提高脐血造血干细胞的扩增效率和CD34+ 比例。
2.2 合成支架
近年来，多种合成可降解聚合物如聚乙二醇（PEG）、聚二甲硅氧烷（PDMS）、聚己酸内酯（PCL）和聚乙烯对苯二甲酸酯（PET）等在组织工程领域被广泛应用，它们有良好的生物相容性、机械性能可控以及便于加工等优点。
PEG支架： Raic A等[10]通过盐析技术制备PEGDA水凝胶，NaCl晶体为致孔剂。333mg PEG-DA溶解在1mL饱和NaCl溶液中，加入终浓度为20μMRGDSK-PEG-丙烯酸盐，黑暗条件下130rpm旋转30mim；200mg PEGDA前驱溶液和800mg 40～100μm大小的NaCl晶体混合转移至一个48孔板的孔中，加入APS、TEMED，迅速混合得到聚合胶状物；切成2mm大小的胶块，再以去离子水溶解致孔物NaCl；当用于细胞培养时，胶块置于乙醇内，在-20℃条件下放置2天，随后冻干；冻干胶紫外灭菌处理后加入细胞悬液和培养基。制备的3D支架与间充质细胞、成骨细胞样细胞作为骨髓微环境成分共培养，比传统2D培养更能保持造血干/祖细胞的多能性。
PEG/PCL支架： Jung YJ等[11]也以盐析原理制备了PEG/PCL水凝胶支架，但没有选择APS和TEMED作为引发剂，而是用AIBN于70℃、12h条件下促进自由基交联反应；该支架可维持造血干细胞的自我更新和造血系统重塑能力，造血干细胞在PEG/PCL为6/14的水凝胶支架条件下生长状态最好。
2.3 复合型材料支架
在实际细胞培养应用中，多采用几种生物材料复合应用，以弥补单一成分的不足，增强多方优点，更好的模拟ECM结构，满足不同的需要。
纤连蛋白包被的PCL支架： PCL支架以50μg/ml的纤连蛋白在4℃包被24h，培养的脐血造血干细胞总细胞数目和CD34+细胞数分别增加了58倍和40倍，而2D培养仅为38倍和2.66倍[12]。
胶原蛋白1包被的PDMS支架：生物相容性材料PDMS被设计成含200μm直径微孔，旋转包被胶原蛋白1，以模拟骨髓微环境。将纯化的CD133+细胞接种于微孔中，并添加细胞因子TPO、FL、SCF体外培养，同时，为了对比，另取细胞接种于24孔板中体外培养，其它条件相同，其3D支架培养的细胞比2D培养有更高的扩增倍数和较低的分化率[13]。
3 3D支架应用过程中需要考虑的问题
不同培养体系培养的细胞最佳临床应用可能存在差异。例如，胶原-磷酸钙粘合支架培养的脐血造血干细胞矿化作用更多，有更多的成骨表达，有希望用于骨科和颅面整形术[14]。以盐析方法制备的PCL支架包被鼠尾胶原蛋白I，在存在角质细胞和成纤维细胞的条件下培养的脐血造血干细胞倾向于T细胞分化和原始淋巴结形成，有希望用于先天性造血和免疫功能失调的患者[15]。
与传统的2D细胞培养法相比，采用3D支架体系培养方法可以更有效的扩增造血干细胞。但是若要收集细胞则需要更多的步骤处理，如胰酶消化，这可能会损伤及减少细胞数目。Madlambayan等[16]设计了一个静态生物加工模式，包含两个用磁性装置分开透气的培养袋，用以除去不需要的细胞。用该方法培养的总细胞数、CD34+、CFU和LTC-IC细胞扩增倍数分别达到了24.6±3.6、30.8±7.2、31.3±5.8和32.6 ±7.5倍。
4 小结与展望
随着细胞因子、蛋白和小分子药物激动剂的鉴定及3D培养技术的迅速发展，造血干细胞的体外扩增技术已经趋近成熟。体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境，该模拟系统中的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。目前，干细胞研究蓬勃发展，再生医学科学方兴未艾，组织工程学研究和应用也已凸显出广阔的应用前景和巨大的市场空间。在造血干细胞治疗和干细胞组织工程领域，模拟体内微环境进行造血干细胞体外扩增可以保证造血干细胞状态稳定，增殖量大，是该领域走向产业化的必然趋势。
【参考文献】
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干细胞培养技术范文第6篇
2010年诺贝尔生物医学奖授予英国生理学家罗伯特•爱德华兹，以表彰他在“体外受精”技术领域做出的开创性贡献。
1978年，罗伯特•爱德华教授和同事一起成功地使第一例试管婴儿诞生，从此开创了生殖医学领域的新纪元。试管婴儿在20多年前也曾被世界舆论界视为洪水猛兽而大加抨击，但时至今日，这项技术已经被全世界绝大多数国家承认，堪称医学史上的一大奇迹。迄今为止，全球已有上百万试管婴儿诞生。
被誉为“试管婴儿之父”的英国剑桥大学教授罗伯特•爱德华说：“克隆单纯从技术上讲非常简单，就是把卵细胞中DNA去掉，然后将体细胞中的DNA移入其中。这在世界上任何一个试管婴儿实验室中都可以完成，困难在于如何降低克隆的危险。”
本文以此热点问题作为命题材料，对2011年高考生物试题进行单项预测。预测材料及其涉及的知识、试题如下：
1．试管婴儿
【知识链接】要做好有关“试管婴儿”的试题，除了书本上的知识外，还要掌握“试管婴儿”技术的有关知识。“试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的和卵细胞取出在试管中完全受精，并在试管中培养使其发育到囊胚期，再将胚胎移入女性子宫内使其发育成胎儿。
体外受精步骤包括：的采集与培养、卵母细胞的获取与培养、体外受精等操作技术。具体过程如下图:
哺乳动物胚胎发育的过程大体概括如下图：
例1 下列关于关试管婴儿的说法，不正确的是（）
A. 从良种母牛体内采集的卵母细胞都需要进行体外培养
B. 从良种公牛采集的需进行获能处理
C. 早期胚胎移植的意义在于提高优良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵发育至原肠胚时期的胚
解析：本题考查了试管婴儿的相关知识。根据体外受精和胚胎发育过程图解可知，早期胚胎指的是由受精卵发育至囊胚时的胚。
答案：D
例2 据2008年1月17日《干细胞》杂志报道，某科学家使用了进行试管受精的年轻女性捐献的卵子，以及2名志愿者的皮肤成纤维细胞，成功克隆出了5个人体胚胎，进而可以开发出有研究价值的干细胞。请回答：
（1）上述过程中主要应用到的两项动物细胞工程技术为；若将某经过修饰的基因导入其中的部分胚胎干细胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培养基进行胚胎干细胞培养时，通常需要加入等天然成分；在细胞培养时，要保证被培养的细胞处于一定的气体环境，所需要的气体主要有 。
（3）科学家欲进行胚胎分割移植，则应该选择发育良好、形态正常的或囊胚，将其移入盛有操作液的培养皿中，然后用分割针进行分割。
答案：（1）动物细胞培养、细胞核移植显微注射技术（法）
（2）血清（血清、血浆） 氧气和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知识链接】克隆人的基本原理是动物细胞核的全能性，包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植。其基本过程为：
细胞核移植技术中注入去核卵母细胞中的不是供体细胞核，而是整个细胞，伴随着两细胞融合，体现细胞膜的结构特点：具有一定的流动性。该技术形成重组细胞继而发育成一个新个体，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。
例3 下图为克隆人的示意图，据图回答：
（1）图中所涉及的现代生物技术有、和
等。
（2）下列有关胚胎移植的叙述正确的有（）
A.冲卵指的是从子宫中冲出胚胎，而非冲出卵子
B.只有供、受体生理环境高度一致，移入受体的胚胎才能被接受，并继续发育
C.供体和受体要进行免疫检查，防止发生免疫排斥反应
D.不同动物其胚胎移植的时间不同，人的胚胎移植最好在四个细胞阶段进行
（3）图中两个婴儿长大后，外貌、性格和其他特征与原型男人相同，这说明 具有全能性。
（4）使用培养基进行胚胎干细胞培养时，通常要加入等天然成分，除了保证被培养细胞处于无菌、无毒及充足氧气的环境中，还需要保证细胞生活所需的；早期胚胎发育在阶段以前的细胞是全能细胞。
（5）图中从“内细胞团到胚胎干细胞”的培养过程中，必须用处理内细胞团，使之分散成单个细胞。干细胞形成组织、器官必须要进行 和 。
（6）在体外培养胚胎干细胞能否获得动物器官?
。为什么？
解析：（1）该图利用了细胞核移植、动物细胞培养、胚胎分割移植等技术。（2）冲卵一般是指是胚胎收集中的冲卵――胚胎、早期胚胎。供体和受体只有保证具有相同的生理状态，才能保证胚胎的正常发育。（3）克隆过程说明动物细胞核具有全能性。（4）动物细胞培养液的成分包括葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。（5）动物细胞培养过程常用胰蛋白酶处理组织，以使之分散成单个细胞。（6）胚胎干细胞在体外培养条件下一般只能增殖进行细胞分裂，不能发生细胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 细胞培养（另外写细胞融合、胚胎分割也对，写了三个则给满分）（2）ABD（3）动物体细胞核 （4）血清 温度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 细胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干细胞在体外培养条件下可以增殖而不发生分化
3．生物技术中的伦理问题
【知识链接】生物技术引发的伦理问题包括克隆技术引发的伦理问题、试管婴儿引发的伦理问题、基因检测引发的伦理问题。中国政府对于克隆技术的态度是禁止生殖性克隆人，不反对治疗性克隆人；对于试管婴儿的态度，中国卫生部的规定是实施体外受精、胚胎移植及衍生技术必须获得卫生部的批准证书。
例4下图所示为人类“治疗性克隆”的大致过程。请回答下列问题：
（1）图中①为 细胞，过程A是目前实现体细胞克隆的关键技术，该技术称为 。
（2）图中③能诱导分化出神经细胞、血细胞、肌肉细胞，其根本原因是 的结果。这样培育得到的组织器官进行自体移植的最大好处是 。
（3）若应用转基因技术治疗遗传性糖尿病，可将健康人的控制胰岛素合成的基因导入结构④中的
，原因是这些细胞 。
（4）在用PCR技术扩增胰岛素基因时，缓冲溶液中必须加入的物质有：、分别与两条模板链结合的两种引物、 以及四种脱氧核苷酸。DNA的合成方向总是从子链的延伸。
（5）我国政府禁止生殖性克隆，但不反对治疗性克隆研究。为什么要反对生殖性克隆（即克隆人）呢？请你写出一条理由： 。
解析：从图可以看才出，治疗性克隆是将患者的体细胞的核与卵细胞的细胞质进行重组， 形成重组细胞，将重组细胞经过培养得到囊胚，取囊胚内细胞团培养得到不同组织器官，可用于进行自体移植，不会产生免疫排斥反应。
答案：（1）次级卵母（卵） 核移植
（2）基因选择性表达不会产生排异（免疫排斥）反应
（3）内细胞团分化程度极低（或具有全能性），可使外源基因在相应组织细胞表达
干细胞培养技术范文第7篇
关键词：人才培养模式；细胞工程技术；教学改革
中图分类号 G642.0 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）01-02-152-02
细胞工程是生物制药工业中的关键技术，它是利用动物细胞体外培养和扩增来生产生物产品，或者作为发现和测试新药的工具[1]。就目前而言，高校细胞工程技术教学中还存在着一定的问题，如教学内容陈旧，不适合生物类企业对职员的知识和技能需求；教学方法还停留在高等教育的初级阶段，教学效果不高[2]等。因此，我们必须加快细胞工程技术类型人才培养模式的改革，进行细胞工程技术教学模式和课程的改革与创新，通过有效的教育模式来提高教学质量，让学生既掌握细胞工程关键技术的基本理论和基本方法，又能掌握细胞工程学科技发展中产生的新技术、新方法，提高学生的创新能力。笔者从教学内容与生产、双语教学、生产学习与实验技能几个方面对提高技能型人才培养目标的教学模式进行了探索研究，以期培养学生的学习能力、实践能力、创新能力，全面提高教学的质量和效率。
1 教学内容与生产整合
细胞工程学课程内容是按照细胞的主要结构及其功能、相关技术讲解的，课程包括细胞工程学发展史、细胞工程学概述、细胞培养及生物学特性、细胞融合、干细胞工程学、细胞克隆及克隆动物与转基因动物技术等；考虑到细胞培养技术在科研中普遍应用，目前细胞工程学实验课另外开设了免疫组化、荧光细胞染色与细胞分选、流式细胞仪操作技术、图像处理等课程。
本科学习中，细胞工程学教学中主要以各种细胞培养为主要线索，了解细胞工程技术具有特定的研究方式，使得他们对细胞工程学有一个全面的认识。例如，动物细胞工程技术应用于诊断和治疗疾病的单克隆抗体生产，有几千种单抗用于生化检测，而单抗用于人体疾病治疗是近几年来生物制药的一个重要领域，有几十种单抗药物正处于临床试验中。通过实验，学生理解单克隆抗体生产制备技术，并掌握原代及传代细胞培养技术、培养细胞的观察方法、细胞融合和分选技术等方法和常用设备的使用方法，为以后的生产研究做好准备。又如，动物细胞表达系统表达的蛋白都是胞外分泌的，产物的分离纯化过程非常简单，但是由于细胞大规模培养技术比较复杂，目前仍处于发展完善阶段，因而许多重组蛋白仍选用原核表达系统生产。我们针对这个特点，启发同学设计较好的细胞大规模培养系统，如改装的灌流式培养方式，培养和启迪学生的创新思维。
2 普通教学与双语教学整合
在当前社会高速发展的时代，社会对细胞工程人才提出了更高的要求，尤其是生命科学院校毕业的学生能否跟上时代的步伐，面向世界进行生物学的交流活动，扩大细胞工程技术在世界的影响，这是细胞工程技术发展至关重要的事。
在细胞工程学原版教材的选择上要力求最基础的专业知识内容水平。我们选择的教材是中国海洋大学出版社2011年10月第1版英文教程《CYTOTECHNOLOGY》，该教材的特点是讲授的内容比较全面，语法简单，对专业性的概念、词汇以及分子水平的知识进行了浅显的讲解，比较适合用于高等院校学生进行细胞工程专业外语的学习，避免学生由于英语基础差，导致对抽象晦涩的细胞工程学课程双语学习产生反感情绪，利于完成双语教学工作。
3 生产学习与实验技能整合
学生创新能力和实践能力的缺乏是高等教育教学改革面临的问题[3]。因此，要带领学生参与科学研究与生产实验技能，强化实践教学环节。细胞工程技术实践教学中，联系生物制品企业生产学习很重要，如我们带领学生到福瑞邦制药的厂家参观学习单抗制备，让学生注意在实验操作中可能失败的原因性，出现问题，及时加以纠正，培养学生良好的实践能力。针对细胞工程学的实验教学特点，穿插设计探索性和综合性的实验内容，并让学生自己参与到实验内容的设计，并调动学生的独立思考能力和创新思维能力，培养实验技能和创新思维能力。
实验大纲列出的实验项目较多，可整合为三大部分：（1）细胞培养综合实验。包括培养技术及细胞观察，细胞培养实验还可以将兔角膜上皮、基质及内皮细胞种植于生物材料上进行体外培养，观察培养细胞的生长、排列和细胞的粘附情况等。（2）经典单抗制备综合实验。将单抗制备产生过程中的细胞培养、动物免疫、细胞融合，杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化，抗体检测5个实验内容整合为1个单抗制备设计性实验。教学中不为学生准备传统的实验讲义，只提出实验的任务、要求、进度及安全注意事项等，重点突出学生自行完成相关资料查阅，自拟设计方案，自己安排时间完成实验计划，获得实验结果，撰写实验报告。这个实验计划6个课时，2次课堂实验，分别以实验设计、中期实验讨论与交流、实验结果课件汇报为主要内容。（3）流式细胞仪分选细胞综合实验。包括分选淋巴细胞或是干细胞的筛选，要求学生根据生产实践需要（如奶牛细胞的分选、白细胞计数及分选等）自己选择课题，自己设计实验方法以及最后鉴定。这个实验计划12个课时，4次课堂实验，分别以实验设计、中期实验讨论、实验结果课件汇报为主要内容。所有实验的实验室全天性开放，学生可利用课余时间主动完成各项实验操作，老师指导，确保学生在30d内获得全部实验结果。老师可根据实验结果反馈及时调整教学进程和教学方法。通过学生的反馈，可以反映学生是否理解和掌握本课程的目标，并加强了教师与学生之间的沟通，提高了教学效果。
参考文献
[1]胡显文，肖成祖.细胞工程在生物制药工业中的地位[J].生物技术通讯，2001，12（2）：117-122.
干细胞培养技术范文第8篇
一、 热点题型分析
热点题型1 对比体内、外受精及其早期胚胎发育过程，解答胚胎工程原理题
例1 下列有关哺乳动物和卵细胞的发生以及受精作用的叙述中，正确的是（ ）
A. 采集到的和卵细胞相遇即可发生受精作用
B. 排卵就是排出成熟卵细胞的过程
C. 卵细胞形成时的分裂过程均在卵巢内完成
D. 受精作用完成的标志是在卵黄膜和透明带之间观察到两个极体
解析 本题考查、卵细胞的形成及体外受精的知识。熟记、卵子及受精过程是正确解答该题的关键。采集到的必须经获能处理后才能受精，采集的卵细胞若是通过冲卵取出的，则不需要培养直接就可与获能的受精，若从卵巢取出的卵细胞则需要培养成熟后才可以与获能的受精；排卵排出的可能是初级卵母细胞或次级卵母细胞，而不是成熟的卵细胞；哺乳动物卵细胞形成的场所，未排卵之前是在卵巢进行的，排卵之后减数分裂的继续完成则是在输卵管中。
答案 D
例2 下图表示蛙的受精卵发育至囊胚过程中，DNA总量、每个细胞体积、所有细胞体积之和、有机物总量的变化趋势（横坐标为发育时间）。其中正确的是（ ）
A. ①② B. ①③
C. ②④ D. ③④
解析 本题考查的是动物早期胚胎发育过程中物质及细胞结构变化情况。熟悉胚胎的早期发育过程是正确解答该题的关键。受精卵发育成囊胚的过程中，需要通过细胞的有丝分裂，使细胞数目增多。该过程中每个细胞DNA含量不变；所有细胞中总DNA量为2N・2N，呈指数函数形式增长；囊胚的总体积不变，但由于细胞数目增多，故每个细胞的体积减小。细胞有丝分裂过程需要消耗能量，能量由细胞呼吸过程中有机物氧化分解产生，故有机物总量在减少。
答案 A
例3 请回答下列与哺乳动物和卵子发生有关的问题：
（1） 精细胞经变形后，高尔基体发育形成的顶体，顶体内含有的_______能协助穿过卵母细胞的放射冠和透明带。
（2） 某动物排卵时，减数第一次分裂尚未完成，此时卵子处于_________卵母细胞阶段。当该细胞发育至减数第二次分裂______期时，才具备受精能力。若在卵黄膜和透明带之间看到两个极体，则表明_________过程已完成。
（3） 动物的早期胚胎移植到同种且____
________与供体相同的动物体内，使之继续发育为新个体的技术叫做胚胎移植。为了获得更多的早期胚胎，常用______________激素对供体进行处理，其目的是获得更多的___
___________，经人工授精后可得到早期胚胎。用某染料鉴定胚胎细胞是否为活细胞时，发现活胚胎细胞不能被染色，其原因是活细胞膜_______________。
（4） 若要通过胚胎移植获得遗传物质完全相同的两个新个体，可对发育到桑椹胚或囊胚阶段的早期胚胎进行______________处理，再植入到受体内。若要对早期胚胎进行长期保存，应将其置于______________条件下。
解析 本题考查受精作用过程。熟记具体受精过程是正确解答该题的关键。（1） 顶体内含有的顶体酶能协助穿过卵母细胞的放射冠和透明带。（2） 动物排卵时处于减数第一次分裂的细胞称为初级卵母细胞，减数第二次分裂中期的细胞才具备受精能力，受精作用完成的标志是在卵黄膜和透明带之间看到两个极体。（3） 胚胎移植时受体的生理状态要和供体一致，才能保证胚胎成活。为了获得更多的早期胚胎，常用促性腺激素对供体进行处理，其目的是获得更多的卵母细胞。细胞膜具有选择透过性，活胚胎细胞不能被染色，原因是细胞膜对染料的吸收具有选择性。死细胞会被染色，因为细胞膜失去选择透过性。（4） 若要通过胚胎移植获得遗传物质完全相同的两个新个体的常用方法是胚胎分割，要注意胚胎一定要分割均匀。生物学中常采用液氮冷冻的方法保存早期胚胎和生殖细胞。
答案 （1） 顶体酶
（2） 初级 中 受精
（3） 生理状态 促性腺 卵母细胞 对物质的吸收具有选择透过性
（4） 胚胎分割 冷冻（或液氮）
题型攻略
【知识储备】和卵子的发生过程的几个重点问题分析：
（1） 哺乳动物卵泡的形成和在卵巢内的储备，是在出生前（即胎儿时期）完成的，这是和卵子在发生上的重要区别，但不是唯一的区别，如发生场所、过程及结果也不相同。
（2） 的发生中两次减数分裂是连续的，是在的曲细精管内进行的。卵子的发生中两次减数分裂是不连续的，减数第一次分裂在卵巢内完成，产生一个次级卵母细胞和第一极体，进入输卵管，在与的结合过程中完成减数第二次分裂，产生一个成熟的卵子和第二极体。当原核融合时，第一极体完成分裂，形成2个第二极体。有的哺乳动物的第一极体不再分裂。
（3） 不同种动物的形态相似，大小略有不同，但与动物的体型大小无关。
（4） 哺乳动物卵巢、卵泡和卵子的关系。
卵巢是卵子形成、卵泡存在的场所，内部包含许许多多不同发育阶段的卵泡，而成熟的卵泡中可释放出卵子，其中卵子的外面有辅助结构――透明带，由卵丘细胞（卵泡细胞）形成放射冠，而卵子外面的胞膜即卵黄膜。排卵指卵子从卵泡中排出，而非卵泡从卵巢中排出。
【易错指导】
（1） 对卵裂阶段，细胞的物质含量和体积大小的变化模糊不清：
① 误认为卵裂阶段的细胞分裂方式包括减数分裂，实际上在该过程中只进行有丝分裂。
② 误认为卵裂阶段细胞中有机物、DNA的含量要增多，细胞体积要增大。受卵膜制约，从受精卵到囊胚阶段总体积不变或略有减小，所以每个细胞体积减少；伴随细胞分裂，细胞数目增多，总DNA含量增多，但每个细胞中DNA含量保持相对稳定；该过程中有机物总量减少，因为一直通过呼吸消耗，但不能从外界吸收。
（2） 不能对胚胎发育与胚胎工程中的有关概念进行正确的区分
① 对、卵子的发生、发育和结合场所不熟；发生场所――曲细精管；卵子的发生场所――卵巢和输卵管；受精场所――输卵管；发育场所――输卵管和子宫；发生时间及特点――初情期后，两次分裂连续进行；卵子发生时间及特点――胚胎性别分化以后，两次分裂不连续。
② 不能正确区分受精的标志和受精完成的标志。看到两个极体是受精的标志，雌雄原核膜融合是受精完成的标志。
③ 对囊胚和桑椹胚在胚胎发育过程中所处的阶段、特点和在胚胎工程中的应用没有完全掌握；胚胎发育过程中开始分化的阶段是囊胚，可以移植或分割的阶段为桑椹胚和囊胚。
④ 忽略“透明带反应”和“卵黄膜的封闭作用”在受精过程中的生物学意义；两者构成了防止多精入卵的两道屏障。
⑤ 体外受精易忽视“获能”和“卵子成热”问题。
热点题型2 关注胚胎工程的应用趋势，解答胚胎工程应用题
例4 胚胎干细胞研究在医学上有重大应用价值。通过移植胚胎干细胞期望可以治疗的疾病是（ ）
①糖尿病 ②血友病 ③唐氏综合征（21三体综合征） ④老年痴呆症 ⑤白化病
⑥肝衰竭 ⑦镰刀型细胞贫血症
A. ①②⑤⑦ B. ②③④⑥
C. ①②④⑥⑦ D. ②③④⑤
解析 本题考查胚胎干细胞的应用。理解胚胎干细胞的特点、弄清题目所给疾病的病因是正确解答该题的关键。糖尿病、老年痴呆症和肝衰竭分别是胰岛B细胞、神经细胞和肝细胞受损或衰老引起的疾病，有望通过移植胚胎干细胞的方法加以治疗。血友病和镰刀型细胞贫血症虽然是由于遗传物质改变引起的疾病，其致病基因只在血细胞中表达，只影响血液的功能，有望通过移植造血干细胞的方法加以治疗。唐氏综合征（21三体综合征）和白化病也是遗传物质改变引起的疾病，但影响范围大，不能用移植胚胎干细胞方法进行治疗。
答案 C
例5 自然情况下，牛的生育率很低，通过现代科技手段，可以实现良种牛的快速繁殖。请按照提示，回答下列问题：
（1） 使一头良种雄性黄牛，在一年内繁殖数百头后代，最简便的方法是__________。
（2） 现有一头良种雌性黄牛，采用胚胎移植的方法，可使这头良种牛一年生下数十头自己的后代。其操作过程中需要用激素对该良种母牛（供体）和代孕母牛（受体）进行__
________处理；还要用激素使供体母牛_____
_____。胚胎收集的过程也叫做__________。用于移植的胚胎应发育到__________或____
______阶段。
（3） 采用试管动物技术还可以使普通雌性黄牛产下奶牛、良种肉牛等不同品种小牛。该技术中首先要做的是体外受精和_______。体外受精主要包括__________、__________和__________等几个主要步骤。
解析 本题要求运用胚胎工程的技术手段，快速繁殖良种牛。熟记胚胎工程的技术手段是正确解答该题的关键。（1） 通过人工授精的方法，可以在短时间内大量繁殖优良品种。（2） 胚胎移植进行前，首先要对供体母牛和代孕母牛进行同期处理，同时还要用激素处理供体母牛使其超数排卵；人工收集发育到桑椹胚或囊胚阶段的胚胎进行移植。（3） 试管动物技术包括体外受精和胚胎早期培养，体外受精又包括的采集和获能、卵母细胞的采集和受精三个阶段。
答案 （1） 人工授精
（2） 同期 超数排卵 冲卵 桑椹胚 囊胚
（3） 早期胚胎的培养 卵母细胞的采集
的采集和获能（的获取） 受精
例6 克隆羊的成功不仅奠定了疾病克隆性治疗的基础，又解决了器官移植中供体不足的问题，同时也给人类带来了一些过去尚未遇到的问题。下图为人类对克隆羊技术的拓展图和应用。请据图回答问题。
（1） 图中所涉及的现代生物技术有____
____________________等。（至少写三个）
（2） （多选）下列有关胚胎移植的叙述中，正确的有（ ）
A. 冲卵指的是从子宫中冲出胚胎，而非冲出卵子
B. 只有供、受体生理环境高度一致，移入受体的胚胎才能被接受，并继续发育
C. 供体和受体要进行免疫检查，防止发生免疫排斥反应
D. 不同动物其胚胎移植的时间不同，人的胚胎移植最好在四细胞阶段进行
（3） 图中两个婴儿长大后，外貌、性格和其他特征与原型男人基本相同，这说明_____
_______具有全能性。
（4） 使用培养基进行胚胎干细胞培养时，通常要加入___________等天然成分，除了保证被培养细胞处于无菌、无毒及充足氧气的环境中，还需要保证细胞生活所需的__________和__________；早期胚胎发育在__________阶段以前的细胞是全能细胞。
（5） 图中从“内细胞团到胚胎干细胞”的培养过程中，必须用_________处理内细胞团，使之分散成单个细胞。干细胞形成组织、器官必须要进行__________和__________。
（6） 在体外培养胚胎干细胞能否获得动物器官？__________为什么？____________
_________________。
解析 本题考查胚胎工程的应用及胚胎干细胞的培养与应用，熟记核移植、胚胎移植、胚胎分割等相关过程和胚胎干细胞等相关概念是正确解答该题的关键。
（1） 获得重组细胞，主要采用核移植技术。重组细胞到早期胚胎，涉及到细胞培养。胚胎进入代孕母体，则采用胚胎移植。早期胚胎分为胚胎1和2，通过胚胎分割。
（2） 大量研究表明，受体对移植入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排排斥，这是能够进行胚胎移植的生理基础之一。
（3） 2个婴儿的遗传物质主要来自供核的亲本，将来与供核的亲本外貌很相似。
（4） 由于人们对细胞所需营养物质还没有全搞清楚，因此在在使用合成培养基时，通常加入血清、血浆等天然成分。桑椹胚细胞还没有出现分化，因此认为是全能性细胞。
（5） 胰蛋白酶能使细胞分散开来。
（6） 通过胚胎干细胞体外诱导分化，还可以培育出人造组织器官。但胚胎干细胞在饲养层细胞上或在添加抑制因子的培养液中，能够维持不分化的状态。
答案 （1） 核移植、胚胎移植、细胞培养
（2） ABD
（3） 动物体细胞核
（4） 血清 温度 pH 桑椹胚
（5） 胰蛋白酶 细胞分裂 细胞分化
（6） 不能 胚胎干细胞在体外培养条件下可以增殖而不发生分化
题型攻略
【知识储备】 试题出现的与“胚胎工程”高频知识点总结：
（1） 胚胎移植是胚胎工程中最后一道程序，移植的胚胎必须在原肠胚之前，不能直接移植受精卵。
（2） 移植胚胎来源及生殖方式：核移植后进行早期胚胎培养（无性生殖）；体外受精后进行早期胚胎培养（有性生殖）；体内受精冲卵胚胎移植（有性生殖）。
（3） 促性腺激素两次处理：①同期处理；②超数排卵。
（4） 两次检查：①收集胚胎检查；②移植后是否妊娠检查。
（5） 对囊胚进行分割时，要注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
【易错指导】
（1） 误认为胚胎移植过程中的冲卵冲出的是卵子；应该是早期胚胎，而不是冲出卵子。体外受精过程中的冲卵冲出的是卵子。
（2） 误认为高等哺乳动物的卵子就是成熟的、已经完成减数分裂的卵细胞；实际上能和结合的卵子的主要部分是处于减数第二次分裂中期的次级卵母细胞，在与的结合过程中完成减数第二次分裂。
（3） 因为胚胎干细胞的分裂能力强、分化程度低，误认为胚胎干细胞的体积也较大；实际上胚胎干细胞的特征是体积小、核大、核仁明显。
巩固训练
1. 下列关于哺乳动物胚胎发育和胚胎工程的叙述中，正确的是（ ）
A. 胚胎干细胞具有发育全能性，它可发育成新个体
B. 滋养层细胞发育成胎膜和胎盘是在囊胚期
C. 诱导胚胎干细胞分化的培养基中不需要加入饲养层细胞
D. 胚胎工程的操作对象是受精卵，而不是生殖细胞
2. “试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的和卵细胞取出在试管中完成受精，并在试管中培养使其发育成早期胚胎，再将胚胎移入女性子宫内发育成胎儿。它不仅使一部分不能生育的男女重新获得了生育的机会，也为人类的优生开辟了新的途径。“试管婴儿”所涉及的技术和原理不包括（ ）
A. 克隆技术 B. 细胞膜融合
C. 细胞培养 D. 胚胎移植
3. 在试管牛的生产过程中，不是必需的操作是（ ）
A. 卵母细胞的采集和培养
B. 受精卵中导入抗病毒基因
C. 的采集和获能
D. 胚胎的早期培养和移植
4. 科学家已成功地利用人体表皮细胞制造出了具备胚胎干细胞功能的细胞（即类胚胎干细胞），下列有关叙述中，错误的是
（ ）
A. 表皮细胞是高度分化的细胞
B. 类胚胎干细胞能够分化成多种细胞
C. 表皮细胞和类胚胎干细胞具有相同的基因组
D. 表皮细胞在形成过程中丢失了某些基因
5. 哺乳动物的下列四种生理活动发生的顺序是（ ）
①透明带反应 ②透明带破裂
③顶体反应 ④卵黄膜封闭
A. ①②③④ B. ③①④②
C. ④③②① D. ①③②④
6. 高等哺乳动物受精后不久，受精卵开始进行细胞分裂。经桑椹胚、囊胚、原肠胚和组织器官的分化，最后发育成一个完整的幼体，完成胚胎发育的全过程，下列有关叙述错误的是（ ）
A. 右图是胚胎发育过程中囊胚期示意图，①、②、③依次称之为透明带、滋养层、内细胞团
B. 高等哺乳动物胚胎发育经历的时期是受精卵卵裂期桑椹胚囊胚期原肠胚期幼体，其中最关键的时期是原肠胚期
C. 高等哺乳动物胚胎发育中的细胞分化开始于囊胚期，终止于生命结束
D. 进行胚胎分割时，应选择原肠胚期的胚胎进行
7. 科学家已成功地利用人体表皮细胞制造出了具备胚胎干细胞功能的细胞（即类胚胎干细胞），下列有关叙述中，错误的是
（ ）
A. 类胚胎干细胞与人体表皮细胞相比，功能有差异，形态、结构也有差异
B. 类胚胎干细胞和表皮细胞中的DNA、mRNA和蛋白质都完全相同
C. 表皮细胞在形成过程中基本上没有丢失基因
D. 人体表皮细胞的质核比（细胞质/细胞核的比值）比类胚胎干细胞的大
8. 为了加快优良种牛的繁殖速度，科学家采用了以下两种方法：
请根据图示信息回答：
（1） 试管牛和克隆牛的培育过程中均用到的工程技术有________、________等。
（2） 用来促进B牛多排卵的激素可能是________分泌的促性腺激素。对D牛要进行________处理。此外受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生________反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能；判断卵子是否受精的标志是________。在受精的过程中，首先发生________反应释放出有关的酶直接溶解卵丘细胞之间的物质。防止多精入卵的生理反应有________。E牛的性别是________。为了确保得到所需性别的试管牛，往往需要对移植前的胚胎进行性别鉴定，请举出两种对早期胚胎进行性别鉴定的方法（只需写出名称或简要原理）____________。
（3） 产生F牛的理论依据是________，其生殖方式属于________。请再举一例克隆牛的培育技术________。
（4） 要培育高产奶率的转基因牛，如建立的生产生长素的生物反应器，即：科学家将________重组在一起，通过_________等方法，导入牛的__________中，转基因牛乳腺细胞中含有较多的参与分泌物加工的________等细胞器。
9. 请回答下列有关细胞工程和胚胎工程的问题：一对健康夫妇生下一男婴，1岁时脑出血死亡，2年后女方怀孕6个月时，经羊水及脐带血诊断为男孩且患血友病，遂引产。于是夫妇俩到广州中山医附属一院做试管婴儿。医生培养7个活体胚胎，抽取每个胚胎1~2个细胞检查后，选两个胚胎移植，最后一个移植成功，出生了一健康女婴，她是我国第三代试管婴儿。请回答：
（1） 试管婴儿技术作为现代生物技术和母亲正常怀孕生产的过程的相同之处是____
________，不同点在于____________。
（2） 医生抽取活体胚胎的1或2个细胞后，可通过观察____________判断早期胚胎的性别，你认为医生应选用______性胚胎进行移植，应用现代生物技术，现在人们已能够选取最理想的胚胎，其基因型应该是_______
_____。自然状态下，出现这样的胚胎的概率是____________。该实例体现了现代科学技术应用于社会和人类生活的重要意义。
（3） 供体器官的短缺和排斥反应是制约器官移植的两个重要问题。而治疗性克隆能最终解决这两个问题。下图是治疗性克隆的过程图解：
Ⅰ. 请在上图中横线上填上适当的术语：①____________；②____________。
Ⅱ. 上图中的③④表示的生理过程是__
__________。
10. 胚胎移植的基本程序如下图，据图回答下列问题：
（1） 对供体母牛、受体母牛进行的①处理是_________。处理的方法是_________。
（2） 在哺乳动物的受精过程中，有哪些机制可以防止多个入卵受精__________
_________________________________。
（3） 在输卵管内，次级卵母细胞的减数第二次分裂是在___________________过程中完成的。判断卵子是否受精的重要标志是____________________________。
（4） 冲卵之后要进行质量检查，这时的胚胎应发育到____________阶段。
（5） 哺乳动物排卵后，不管是否妊娠，在一段时间内，同种动物的供、受体_____
_____________是相同的，这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。供体胚胎移入受体后可与受体子宫建立___________，但移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程中_____________________。
（6） ②处理是_____________。
（7） 在胚胎工程中通过任何一项技术，如________________________等技术获得的胚胎，都必须移植给受体才能获得后代。
参考答案
1. C 2. A 3. B 4. D
5. B 6. D 7. B
8. （1） 动物细胞培养 胚胎移植
（2） 垂体 同期 免疫排斥 在透明带和卵黄膜间有两极体 顶体 透明带反应和卵黄膜封闭作用 雌性或雄性 DNA分子杂交技术（利用基因探针鉴定），分析胚胎细胞的染色体组型
（3） 动物细胞核的全能性 无性生殖
胚胎分割
（4） 生长激素基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件 显微注射法 受精卵 内质网、高尔基体、线粒体
9. （1） 双亲生殖细胞都融合为合子 试管婴儿是体外受精，胚胎移植的产物 （2） 性染色体形态 女 XBXB 1/4 （3） Ⅰ. ①细胞核 ②内细胞团细胞 Ⅱ. 细胞分化
10. （1） 同期 用促性腺激素处理
（2） 透明带反应、卵黄膜封闭作用
（3） 和卵细胞结合 在卵黄膜和透明带的间隙里可以观察到两个极体
（4） 桑椹胚或囊胚
（5） 生殖器官的生理变化 正常的生理和组织联系 不受任何影响
干细胞培养技术范文第9篇
【关键词】 骨骺干细胞 永生化 猿肾病毒40
Abstract：［Objective］To separate rat precartilaginous stem cells (PCSCs) and establish immortalized precartilaginous stem cell(IPCSC) strain which provides stable cell resource for cell-transplantation and gene therapies.［Method］PCSCs were isolated by discontinuous Percoll gradient centrifugation. The specific marker (anti-FGFR-3) of PCSCs was used to identify the cultured cells by immunocytochemistry. Plasmids pCMVSV40T/PUR containing the simian virus 40 large T antigen gene (SV40Tag) were transfected into the PCSCs by electroporation method. Colonies were isolated by puromycin selection and amplified to cell strain.The expression of SV40Tag in the amplified cell strain was identified by immunocytochemistry and RT-PCR. Anti-FGFR-3 and anti-PCNA were used to identify the cultured cells after puromycin selection.［Result］One anti-puromycin cell clone was obtained， which was confirmed as FGFR-3 positive PCSCs with the capability of proliferation. The mRNA and protein expression s of SV40Tag were detected in transfected cells after stable transfection. The transfected cells were amplified to immortalized cell strain maintained for more than 30 passages， named immortalized precartilaginous stem cells(IPCSCs). The population doubling time and anti-PCNA positive confirmed the high capability of proliferation.［Conclusion］Rat precartilaginous stem cells were purifued and immortalized precartilaginous stem cell strain was established successfully. It will provide stable cell resource for the basic researches and cell-transplantation therapies.
Key words：precartilaginous stem cells; immortalization; simian virus 40
骨骺干细胞(precartilaginous stem cells，PCSCs)是控制生长期动物肢体生长的、能定向分化的成体干细胞[1]，它作为组织工程的种子细胞，可用于软骨与骨缺损的细胞替代治疗[2]。由于PCSCs在第五代左右即开始分化[3]，原代细胞培养技术尚不能在体外获得大量表型一致的PCSCs。建立永生化骨骺干细胞株，将为研究骨骺细胞分化机制以及组织工程提供大量表型、基因型稳定的骨骺干细胞。本研究拟将猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)转染至原代培养的大鼠LaCroix环的骨骺干细胞，以期建立永生化骨骺干细胞株，为研究骨骺细胞分化机制以及组织工程提供稳定的细胞来源。
1 材料与方法
1.1 主要材料
1.1.1 实验动物与主要试剂 出生24 h内的SD大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供；Embryo MaxTM-DMEM干细胞专用培养基、CompleteTM Trypsin Solution购自CHEMICON公司；EGF、bFGF购自Cytolab公司；胎牛血清、青-链霉素购自Gibico公司；Ⅰ型胶原酶购自Sigma公司；兔多克隆抗体FGFR-3(c-15)购自Santa Cruz公司；质粒pCMVSV40T／PUR和大肠杆菌菌株分别获赠于瑞典Jan Holgersson教授和同济医院田玉科教授；质粒提取试剂盒购自Axygen公司；内切酶NotI和XhoI购至Toyobo公司；Trizol试剂盒购自GIBCO公司；兔抗鼠SV40Tag抗体和兔抗鼠anti-PCNA购自NeoMarkers公司；SP9000免疫组化试剂盒、ZLI29032浓缩型DAB试剂盒和FITC标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉公司。
1.1.2 引物设计 根据大鼠基因序列设计内参β-actin引物，上游：5'-GTTGACATCCGTAAAGACC-3'，下游：5'-CACCAATCCACACAGAGTA-3'，产物长度为170 bp；根据SV40Tag基因序列设计引物，上游：5'-TATCTTFCAGGT TCAGGG-3'，下游：5'-TGGAATAGTCACCATGAATG-3'，产物长度为558 bp。引物由上海生工公司合成。
1.2 方法
1.2.1 PCSCs的分离与鉴定 参考黄仕龙等的方法，以显微手术器械剪取新生24 h内的SD大鼠股骨下端骺板两侧的La Croix环处的组织[4]，并将其充分剪碎，以CompleteTM Trypsin Solution消化5 min，再以0.1％的Ⅰ型胶原酶37℃消化15～24 h，将细胞按1×106／ml接种于含10 ng／ml bFGF、10ng／ml EGF和0.9％FBS的DMEM培养基中培养。培养48 h后将原代细胞以CompleteTM Trypsin Solution消化，以3 μm单细胞过滤器去除聚集的细胞团成为单细胞悬液，用D-Hank's洗涤后以含0.01％DNA酶的培养基重悬细胞，移至percoll密度梯度液顶层，400 g离心1 h后取第4层细胞以含10 ng／ml bFGF、10 ng／ml EGF和0.9％FBS的DMEM培养基中置于37℃、5％CO2培养箱中培养。第2代骨骺干细胞消化后接种于放有灭菌小玻片的12孔板中，将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞长满玻片50％～60％时以4％的多聚甲醛固定30 min，Triton-X100破膜20 min。应用HRP／DAB免疫细胞化学法按照SP试剂盒说明书步骤进行FGFR-3抗体染色，苏木素复染。
1.2.2 质粒扩增、提取及鉴定
含质粒pCMVSV40T／PUR的大肠杆菌在含有氨苄青霉素25 μg／ml和四环素10 μg／ml的LB培养基中以250 r／min摇菌12～16 h，质粒提取按照质粒提取试剂盒说明进行。获得的质粒以灭菌三蒸水洗脱后置于低温冰箱保存。取每个反应体系1 μg应用Xho I和Not I分别进行单酶切和双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1.2.3 电穿孔转染法转染骨骺干细胞
将PCSCs接种于100 ml培养瓶中，调整细胞密度使其在转染当天能收获(2.5～3.0)×105个对数生长期的细胞。用CompleteTM Trypsin Solution消化瓶内细胞。用预冷的PB-蔗糖(272 mmol／L蔗糖，7 mmol／L磷酸钠缓冲液pH 7.4，1 mmol／L MgCl)离心洗涤细胞2次。用20 μl冰PB-蔗糖重新悬浮细胞，加入质粒pCMVSV40T／PUR 1.0 μg，轻轻混匀。移入0.2 mm的电转杯中冰浴5 min。电转参数设置：总电压200V，调幅100％，调频40 kHz，脉冲时间1 ms，脉冲值5，脉冲间隔1 s。电转结束立即加入1 ml含10 ng／ml bFGF、10 ng／ml EGF和0.9％FBS的DMEM培养基，冰浴10 min后，接种于24孔培养板。置37℃、5％CO2培养箱内继续培养。
1.2.4 转染细胞的筛选、扩大培养及鉴定
细胞转染后24 h，以含0.5 μg／ml 嘌吟霉素的培养基筛选12～14 d，阳性克隆以含0.4 μg／ml嘌呤霉素培养基扩大培养。以转染后的细胞制作细胞爬片，应用免疫细胞化学法进行FGFR-3抗体染色，应用FITC标记的免疫荧光法检测SV40Tag抗体染色。用Trizol试剂盒提取第2代骨骺干细胞和第4、10、30代永生化骨骺干细胞的总RNA，进行逆转录。内参B-actin的PCR反应条件为：94℃预变性5 min，然后进入30个循环：94℃ 1 min，53℃ 50 s，72℃ 50 s，最后再72℃延伸8 min。SV40Tag的PCR反应条件为：94℃预变性5 min，然后进入30个循环：94℃ 1 min，56℃ 50 s，72℃ 50 s，最后再72℃延伸8 min。PCR产物以1.0％琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.5 绘制细胞生长曲线和计算群体倍增时间(PDT) 将第2、6、10代骨骺干细胞(PCSC2、PCSC6、PCSC10)及转染后第30代永生化骨骺干细胞按1×102个/孔接种于24孔板，每隔24 h常规消化3孔细胞并计数，绘制生长曲线，按照下列公式计算细胞PDT：PDT=[1g2／(1gN11gN0)]×t，其中N1和N0分别代表接种后和培养t h后的细胞数。统计学处理采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示。不同细胞间比较采用单因素方差分析，P
2 结 果
2.1 PCSCs的分离与鉴定 Percoll梯度离心分离得到的骨骺干细胞贴壁生长，折光性好，以梭形或三角形为主(图1)。免疫细胞化学检测可见细胞呈FGFR-3染色阳性，细胞染色部位主要在胞膜(图2)。
2.2 质粒扩增、提取及鉴定
质粒pCMVSV40T／PUR酶切产物电泳分析(图3)显示质粒载体经Not I或Xho I单酶切各得到一条约5.3 kb的条带；经Not I和Xho I双酶切得到约2.3 kb和3.0 kb的2条带，目的基因约2.3 kb与Genbank中的SV40Tag cDNA长度一致。
2.3 转染细胞的鉴定
转染细胞经筛选培养后获得1个阳性细胞克隆。贴壁培养的细胞形态与原代培养的骨骺干细胞没有明显差别。免疫细胞化学检测显示永生化骨骺干细胞的FGFR-3和PCNA抗体染色阳性(图4、5)，免疫荧光检测显示永生化骨骺干细胞的SV40Tag抗体染色阳性(图6)，RT-PCR结果显示在约560 bp处有一特异形扩增条带，而未转染的原代细胞未见条带(图7)。
2.4 细胞生长曲线和群体倍增时间 第2、6、10代的骨骺干细胞以及转染后第30代永生化骨骺干细胞生长曲线均呈“S”形(图8)，第10代后骨骺干细胞增殖速度明显变慢停止，细胞出现衰老现象；第30代骨骺干细胞增殖速度明显快于第6、10代骨骺干细胞。永生化骨骺干细胞一般6～7 d传代1次。四者的PDT分别为(29.1±3.1)h，(34.2±3.0)h，(43.5±3.4)h，(28.7±2.9)h，其中PCSC2和第30代IPCSC的PDT明显低于第6、10代骨骺干细胞(P0.05)。图1 Percoll梯度离心获得的PCSCs×200 图2 PCSCs的PGFR-3染色，苏木复染×200 图3 质粒pCMVSV40T/PUR酶切产物琼脂糖凝胶电泳分析 ①Marker VI(由下至上依次为250、1 000、2 500、5 000、7 500、1 000 bp);②经双酶切得到约2.3 kb和3.0 kb的2条带；③经Xho I单酶切得到1条约5.3 kb的条带；④经Not I单酶切得到1条约5.3 kb的条带 图4 第30代IPCSC的FGFR-3抗体染色，苏木素复染×200 图5 第30代IPCSC的PCNA抗体染色×100 图6 第30代IPCSC的SV40抗体染色×100 图7 RT-PCR检测培养细胞SV40Tag mRNA的表达（170 bp处为内参β-actin，560 bp处为SV40Tag） ①Marker I(由下至上依次为100、200、300、400、500、600 bp);②第2代PCSCs ③第4代IPCSC ④第10代IPCSC ⑤第30代IPCSC 图8 PCSCs和IPCSC的生长曲线
3 讨 论
1999年Robinson等人分离出骨骺干细胞[1]，为研究骨骺发育问题提供了新的思路，同时也为组织工程找到一种所需要的种子细胞。目前骨骺干细胞的研究已成为骨科领域的一个新热点。近年来游洪波等对骨骺干细胞进行了纯化[5]，为研究骨骺干细胞向软骨细胞分化、更深入地进行软骨组织工程的研究奠定了基础。但骨骺干细胞的研究还有许多的难题等待作者去解决。首先，由于骨骺干细胞在第5代左右即开始分化[3]，原代细胞培养技术尚不能在体外获得大量表型一致的骨骺干细胞。细胞的增殖一直是一个瓶颈问题，如何获得组织工程所需要的种子细胞的数量，国内外尚未有很好的解决方案。其次，要明确使细胞向软骨及骨细胞分化的基因和环境信号、如何控制骨骺干细胞向软骨细胞分化，都需要进一步深入研究。
猿肾细胞病毒SV40由结构蛋白(VP1、VP2、VP3)和2种抗原(大T抗原和小T抗原)组成［6］。大T抗原为细胞转化启动所必需，对转化起决定作用，而且转化细胞表型的维持必须依赖大T抗原的持续表达[7]。SV40Tag是目前较为常用且有效的体外永生化细胞的基因片段之一，可通过与生长抑制因子pRB、p53和SEN6相互作用，避免细胞进人凋亡，延长细胞寿命，并使细胞最终度过危机期，实现永生化[8]。本实验利用电穿孔转染技术将含有SV40Tag的质粒转染体外培养的大鼠PCSC。RT-PCR及免疫荧光检测SV40Tag抗体证实SV40Tag已稳定转导入骨骺干细胞中，并在基因和蛋白水平均有表达。转染后细胞形态与原代骨骺干细胞无明显区别，以多角形和短梭形为主，一般5～6 d传代1次。同时转染后细胞的免疫细胞化学FGFR-3抗体和PCNA抗体染色均为阳性，证实细胞在转染后仍具有骨骺干细胞的基本特性。该细胞株目前已传到了第30代，尚未观察到明显的分化现象。这些结果说明SV40Tag能成功地介导体外培养骨骺干细胞的永生化。
本研究成功地构建了SV40Tag永生化的大鼠骨骺干细胞株，为研究骨骺细胞分化机制以及组织工程提供稳定的细胞来源。
【参考文献】
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干细胞培养技术范文第10篇
细胞培养基和细胞培养工艺是生物制药和疫苗产业中最关键的部分，我国在此领域人才奇缺，在“”的呼唤下，有着近30年海外背景的罗顺回国创业，为祖国发展贡献自己的智慧。
从国际知名科研工作者，到兼具科研创新、经营管理等多重素质的综合型人才，罗顺实现了角色的成功转型，也在生物制药王国画下壮美的蓝图。
“1号”人才引进回国
美国钢铁大王卡耐基曾说过：将我所有的工厂、设备、市场、资金全部夺去，但是只要保留我的组织人员，四年之后，我仍将是一个钢铁之王。1950年，钱学森决定返回祖国时，主管他研究工作的美国海军次长大为震惊。他认为：钱学森无论在哪里都抵得上五个师。他说，我宁肯枪毙他，也不愿放他回中国。这充分说明了科技人才对一个企业乃至一个国家的重要性。不论在国外还是回国发展，罗顺都是这种不可替代的人才。
罗顺是从华中农业大学毕业后走出国门的，那是1985年，当时算是公派留学。去美国有一个明确的目的，就是希望研究生物化学的一些特性。结合大学学生物化学时研究过酶的一些特性，罗顺开始了对酶的表达情况的研究。
在美国，罗顺一鼓作气，完成俄勒冈州立大学生物化学专业硕士、弗吉尼亚理工大学分子生物学博士学位，并在哈佛大学医学院完成针对癌症的博士后研究。毕业后，因为出色的科研才华受到美国各大知名制药公司的青睐，他先后供职于瑞士制药公司、美国Beckman Coulter公司、美国基因XP生物技术公司、美国细胞培养基公司、美国基因泰克生物制药、美国安进生物制药。在美国待了近30年，罗顺的事业和生活就像他的名字一样，顺风顺水。
2011年的中国生物制药行业，方兴未艾，面临新的发展机遇。2008年陆续回国的同事和朋友都纷纷劝他回国发展生物制药。如果继续留在美国，自己创业，基本只能是个梦想;如果回国，能为国内的生物制药贡献自己的智慧。说干就干，罗顺是一个果敢的人，当下决定回国创业。
在罗顺看来，当时的生物制药作为战略新兴产业，国家对其支持力度很大。中国是一个巨大的医药市场，生物制药是它的核心。并且随着人们对生活品质的提升，越来越关注高质量、健康的生命。尽管近年国家也引进了一批生命科学领域里高水平的专家学者，不过这些人更多是从事基础理论研究，缺少实践者。他认为，要把研究成果转换成生产力，转换成社会价值的东西，你必须要通过产业化。而这正是罗顺回国想实现的。
2011年，时任北京市委书记刘淇亲自批示，将罗顺作为国家第六批第一号人才，引进回国。
回国后，在甘肃做投资的朋友的支持下，罗顺将起点选在甘肃兰州。虽然与科技资源相对丰富的北京失之交臂，可罗顺后来发现，这里非常适合开展培养基的研究。
个中艰辛唯有自知
万事开头难。从未有过经营管理经验的罗顺，碰到了一个接着一个的棘手难题，很多都让他始料不及。
“最大的困难是人才。我带回的是美国技术专家团队，他们中大部分人不会说中文，而且很多是学者型的人才，他们有技术但是遇到问题解决不了，不适应国内的环境。”从论文成果到进入市场成为相对成熟的产品，这中间有一个对企业家和科学家来说是高风险、高投入的关键环节，而要实现这一环节的无缝链接，亟需大批既懂经营也懂科技的科技经营人才。为此，罗顺投入很大的精力来培养本土的团队。
第二个需要面对的问题，就是国内的经济环境、政治环境，以及大家对生物制药行业的误解，大家往往觉得今天投资，明天就能有回报。
“生物制药行业是一个长期投资，大量投资，慢回报的一个行业。所以，不论政府方还是投资方都会提出疑问：他们这么厉害，怎么还没赚到钱？整个社会上的反映也会是，干了两年半，怎么还没有成为世界最大的培养基公司？或者新药怎么还没有研发出来？”这一点让刚回国的罗顺颇感憋屈和无奈，“培养基不是做药的，我们是做原材料的，这是理念上需要纠正的。”
最重要的问题是，国内外都对本土公司的技术不看好，没信心。“很多人觉得，中国公司的技术绝对不如美国的公司，美国的东西一定比中国好。”罗顺说，这种心态似乎形成了一种惯性，植根于每个人的头脑中。“美国人觉得中国制药是劣质、质量不好，原材料质量更不好。我现在做生物科技技术，我也有一个理念，我做的是原材料的事，要做到跟世界一样的水平。”这是罗顺的目标。
从国家部委到地方政府，从投资方到合作方，每个人都在寄希望于罗顺，此时的他，背负多方压力，唯有埋首科研、尽心经营，用事实告诉人们，他的目标达到了。
瞄准生物制药的CPU――细胞培养基
细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境，是生物医学工程中最重要的组成部分。细胞培养基市场主要由美国三大公司――美国英杰（Invitrogen/Gibco）、西格玛SAFC Bio、海克隆（Hyclone/GE Health）垄断。中国细胞培养基市场年需求量大约在600～700吨，由于目前中国并没有能够大规模生产细胞培养基的厂家，而现有的几家小型供应商的产品研发能力不足、生产技术和工艺又不成熟，所以产业化需求难以满足，中国市场上95%的培养基都需要依赖从美国进口，从而导致我国生物制药产业受困于成本高、受制于人的窘境，且如果国内研发、生产能力持续落后，发展缓慢，将长期依赖进口。
最初注意到细胞培养基，是罗顺还在美国生物制药公司的时候。当时，美国几家著名的生物制药公司都与他保持着联系，他们希望罗顺能给他们在这方面提供技术支持，或是担任顾问提供指导。朋友们就纷纷劝他，不如回国，开一个细胞培养基的公司。
“就像计算机的CPU一样，再好的计算机PC设计，如果没有CPU这个核心，生产不出好电脑。”罗顺回国后最成功的是，瞄准了生物制药的CPU――细胞培养基。
细胞培养基对生物制药的产业和行业而言，是一种关键的生产原材料，也是一项关键的生产的技术。罗顺早期的研发工作就是围绕生产的工艺开发进行的，主要是细胞代谢理论的研究、细胞培养基的开发、细胞培养工艺的开发。在对细胞代谢理论进行系统研究的基础上，罗顺建立了一个细胞代谢效率的理论，这个理论就是指导我们怎样给细胞提供最有效的营养，而这个最有效的营养组合就是细胞培养基。由他领导的CHO细胞培养课题组以其在业内一流的药用蛋白产量著称于世，创世界最高产量达每升11克，同时拥有3项专利，罗顺本人获得2010年安进科技创新最高奖。自此，他的科研实力在业界声名鹊起。
“我们把美国一流的细胞培养基技术带回来了，等于是带回来国际一流的新产品开发技术研发平台。短期内，可以研发出将近100种细胞培养基配方，这对中国的生物制药产业的意义是巨大的。”任何一个企业，凭借这项独一无二的工艺，就能涉入更多的生物制药领域，打造起核心竞争力。而对整个产业来讲，更是有着“革命”般的作用，它提高了整个产业的生产效率，发挥了榜样的作用。
打造生物科技的“黄埔军校”
如果说罗顺带回的细胞培养基技术，让我国生物制药行业摆脱了美国培养基公司对中国市场的垄断，而且能提高客户公司的生产的效率和核心竞争力。那他带回的干粉工艺流程，更是填补中国细胞培养基干粉生产的空白。
在罗顺的公司，美国CRB设计团队（曾参与编写美国GMP）首次为中国企业设计、监理、建设，并且这也是国内首家引进针磨技术的企业，生产车间采用国际一流的干粉生产设备。针磨技术解决了国内干粉培养基生产时温度、湿度、粒度稳定性等难题，取代了国内传统的球磨工艺，大大减少了培养基在研磨过程中的损耗，使得公司拥有了符合cGMP标准的工业化大规模细胞培养基生产平台，产能可达300吨/年。
在工艺开发的过程中，罗顺深刻地感受到，科学研究、成果转化和应用，人才不仅是一个非常重要的因素，而且是第一因素。甘肃健顺生物科技有限公司在成立之初就决定要培养年轻的人才队伍，因为这对公司的长期发展至关重要。
在此理念的指引下，依托“无血清细胞培养基工程实验室”，团队培养出了一批中国乃至世界的具有扎实理论基础和实践能力的生物技术人才。同时，与当地大专院校（兰州大学、甘肃农业大学、西北师范大学等）、科研院所联合培养人才，以能力培养为核心，综合素质培养为主线，培养技术型人才和高级经营管理人才，并在科学研究和产学研相结合过程中，掌握国际领先的研发设备，逐步探索出符合公司特色的培养体系。
“我们想打造一个开明、民主、自由的公司文化，也像在美国一样，很多年轻人都直呼我的名字。我们提供单身员工的宿舍，我们有食堂，食堂的伙食非常好。我们与高校联合组织篮球比赛、马拉松，给他们提供放手去做的条件，允许他们出错。”
罗顺对于人才培养可谓费尽心思。公司会对培养对象进行专业辅导培训。如：组织国外专家举办生物医药学科的科学讲座，使培养对象深入了解生物医药产业的先进理念和国际领先的技术水平;每周开设外国专家与新进人才在生物医药领域英语、汉语的专业语言交流提高课程，增强科研合作与交流的能力;鼓励和支持培养对象参加学术交流等活动，了解生物医药领域的一些最新研发动态，拓宽年轻人才的知识结构和研究视野。
在培养过程中发扬“传、帮、带”的精神。通过外国专家亲自到实验室指导实验的方式，培养他们的实验动手能力和独立开展科研的能力。在专家们规范严谨的指导下，一批年轻的科研人员已逐步掌握了试验的方法和操作的要领，并成为了我们科研团队的主力军。
同时，还会有计划地安排年轻科研人员跟随专家团队去境外培训进修，促进团队与境外、国外学者的交流，使年轻科研人才逐渐在国内外科学舞台上崭露头角，并逐步培养和成长为中国生物医药界的新生力量。
“我是希望，能打造出中国生物制药工艺开发――细胞培养基的‘黄埔军校’。”罗顺说，如果公司发展到一定程度，希望能在兰州大学或其他高校建立生物工程专业。他说，在美国，也只有为数不多的几所大学拥有这个专业。他希望能把该领域世界一流专家教授都请来讲授，这样，也能为国内这个领域培养更多人才。
携健顺生物扬帆远行
致力于“无血清个性化化学成分界定细胞培养基”及其工艺的研究开发，同时提供培养基配方委托生产、Clonepix细胞株筛选等技术支持配套服务，2011年3月，甘肃健顺生物科技有限公司（以下简称“健顺生物”）成立，罗顺是公司创始人。
“我们的最终目标就是，降低最高端的生物制药的成本，让更多的老百姓用上生物制药。”罗顺深谙生物科技的这一文化核心和理念，“我们哪怕做非常小的一件事情，也是希望为客户降低成本，用药去治病救人，我们公司的文化是植根于此的。”
目前，健顺生物的产品主要应用于生物制药（治疗性重组蛋白，包括单克隆抗体）、细胞治疗以及人/兽用疫苗的工艺开发与生产。
“健顺生物与美国领先细胞培养基公司一样，拥有世界一流的干粉生产线设备技术、工艺流程，年产量可达300吨，这是国内公司所不具备的。最重要的是，与欧美生物制药公司一样，拥有一流的高等生物细胞培养基配方开发基础理论与技术平台，就连美国三大培养基公司都不具备。”健顺生物独具优势的竞争力让他们初战告捷。
公司成立3年来，在罗顺的带领下，凭借自身全球领先的研发技术水平和过硬的产品质量，目前已产生强大的市场价值，已与兰州、成都、上海、广州、山东、北京、武汉、石家庄、浙江、等十多个省市地区超过35家生物药企建立业务联系，与30多家药企已签订了合作协议，并签订了工艺开发技术项目10多项。同时已与上海、成都等多家大型药企签订了培养基长期供应合同，完成了从一开始的10L、100L的小规模供应到现在10000升以上的批量供应的产业化规模，其中国内创新药开发领军（上市）企业康弘药业等多家知名药企已将我公司细胞培养基列入其新药临床申报，将健顺生物细胞培养基确定为其新药的唯一指定原材料供应商。同时，健顺生物与具有全球竞争创新能力的生物医药公司展开合作，签订了10年的委托供应研发协议。
当然，罗顺对公司未来的定位绝不止于此，在他看来，“这不只是一家以技术服务为主的企业和一支成熟的世界领先的技术团队，更重要的是以技术力量所带来的客观周边效应。公司落户兰州，希望能对甘肃生物制药行业的发展产生积极的影响，使甘肃省的高新技术产业园区在全国乃至全世界立于领先地位。”
为中国生物制药行业提供世界一流的细胞培养基与研发服务！力争在细胞培养基领域成为世界一流的技术与产品供应商！填补中国工业化无血清细胞培养技术和产品的空白！而罗顺作为健顺生物的掌舵人，更是踌躇满志、信心满满，相信梦圆时分已不再遥远。
专家简介：
罗顺，甘肃健顺生物科技有限公司创始人、总裁。
美国弗吉尼亚理工大学分子免疫学博士，美国哈佛大学医学院Dana-Farber癌症研究所博士后，毕业后加入瑞士生物制药公司（Serono），从事生物制药研发工作20多年，先后在Beckman Coulter、JRH Biosciences、Sigma SAFC、基因泰克（Genentech）、安进（Amgen）等公司担任要职，主要负责研发技术部门工作，期间创办了GeneXP Biosciences公司。
干细胞培养技术范文第11篇
例1某生物体内有基因A，该基因能控制合成A蛋白，A蛋白是某种药物的有效成分，下图是将A基因导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。据图回答：
（1）获得基因A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在酶的催化下，合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的序列，再通过方法合成所需基因。
（2）利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有、、4种脱氧核糖核苷酸和酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。
（3）下列关于各种酶作用的叙述，不正确的是。
A.DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接
B.RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录
C.一种DNA限制酶能识别一种核糖核苷酸序列
D.胰蛋白酶能作用于离体的动物组织，使其分散成单个细胞
（4）图中的C称为，在基因工程中，常用Ca2+处理D，处理后D更易，此时D称为。
（5）图中最后一步“筛选”是指从转化细胞中筛选出能的大肠杆菌作为工程菌。
【知识要点复习】（1）利用反转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成单链的DNA，逆转录酶具有DNA聚合酶活性，在它的作用下，可合成双链DNA；根据蛋白质来获得目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的脱氧核苷酸序列，再通过人工合成方法合成所需基因。
（2）PCR过程中需要引物、模板DNA、4种脱氧核糖核苷酸和热稳定性DNA聚合酶等物质，故在PCR反应体系中应添加这些物质。
（3）DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接，形成磷酸二酯键，A项正确；RNA聚合酶能与基因上的RNA聚合酶结合位点结合，催化遗传信息的转录，B项正确；一种DNA限制酶能识别一种“脱氧核糖核苷酸序列”而不是“核糖核苷酸序列”，C项错误；胰蛋白酶能将离体的动物组织细胞间质中的胶原蛋白分解，使其分散成单个细胞，D项正确。
（4）由图可知，A为目的基因，B为运载体，二者结合在一起，形成的C称为重组DNA（或重组质粒）。将目的基因导入微生物细胞，常用Ca2+处理受体细胞，使之更易吸收周围环境中的DNA，成为感受态细胞，提高受体细胞的转化率。
（5）目的基因导入受体细菌，是否可以稳定维持和表达其遗传性，可通过检测与鉴定，得到稳定遗传并能表达出A蛋白的细菌作为工程菌。
【答案】（1）逆转录氨基酸脱氧核苷酸
人工合成（化学）（2）引物模板DNA热稳定性DNA聚合（3）C（4）重组DNA（或重组质粒）吸收周围环境中的DNA感受态细胞（5）稳定遗传并能表达出A蛋白
二、胚胎工程、基因工程和细胞工程的综合命题
例2毛角蛋白Ⅱ型中间丝（KIFⅡ）基因与绒山羊的羊绒质量密切相关。获得转KIFⅡ基因的高绒质绒山羊的简单流程图如下。
（1）过程①中最常用的运载工具是，这里也可以用动物病毒或作为运载工具，所需要的酶是限制酶和。
（2）在过程②中，用处理将皮肤组织块分散成单个成纤维细胞。在培养过程中，将成纤维细胞置于和5% CO2的混合气体培养箱中进行培养，培养液中加入达到无菌环境，将成纤维细胞置于5% CO2的气体环境中，CO2的作用是。
（3）在过程③中，用处理以获取更多的卵（母）细胞。成熟卵（母）细胞在核移植前需要显微操作将吸出，处理后得到去核的卵母细胞。
（4）从重组细胞到早期胚胎过程中所用的胚胎工程技术是。在胚胎移植前，通过技术可获得较多胚胎，此技术若选囊胚作材料，应注意的事项是。
【知识要点复习】（1）将KIFⅡ基因导入成纤维细胞内，获得转KIFⅡ基因的高绒质绒山羊的过程采用了转基因技术，而转基因技术的原理是基因重组，过程①是基因表达载体的构建过程，该过程中最常用的运载工具是质粒，此外也可用动植物病毒及λ噬菌体的衍生物作为运载工具，此处不宜用植物病毒；所需要的酶是限制酶和DNA连接酶。
（2）过程②为动物细胞培养过程，该过程需用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）处理，使皮肤组织块分散成单个成纤维细胞，动物细胞培养需要一定的气体环境，即95%空气加5% CO2，CO2的主要作用是维持培养液的pH值。细胞培养需要无菌和无毒的环境，因此培养液中需加入（一定量的）抗生素以达到无菌环境。
（3）过程③表示活体采卵，该过程需用促性腺激素处理母羊使其超数排卵，以获取更多的卵（母）细胞，在体外培养到减数第二次分裂中期时，通过显微操作进行去核处理，将细胞核和第一极体一并吸出。
（4）从重组细胞到早期胚胎过程需采用（早期）胚胎培养技术。在胚胎移植前，通过胚胎分割技术可获得较多胚胎，此技术若选囊胚作材料，应注意的事项是将内细胞团均等分割。
【答案】（1）质粒λ噬菌体的衍生物DNA连接酶（2）胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）95%空气（一定量的）抗生素维持培养液的pH值（3）促性腺激素细胞核和第一极体
（4）（早期）胚胎培养技术胚胎分割将内细胞团均等分割
三、细胞工程和胚胎工程的综合命题
例32015年2月3日，英国议会下院通过一项历史性法案，允许以医学手段培育“三亲婴儿”。三亲婴儿的培育过程可选用如下技术路线。
（1）此过程涉及试管婴儿的培育，它属于（填“无性”或“有性”）生殖，试管婴儿的培育用到的技术手段有：体外受精技术、技术和技术。
（2）该技术培育的“三亲婴儿”的染色体来自细胞，其细胞质基因来自细胞。
（3）据图分析，该技术（填“能”或“不能”）避免母亲的红绿色盲遗传病基因传递给后代，该技术能避免母亲的遗传性视神经病变遗传给后代，推测该疾病的致病基因位于上。
（4）细胞核移植技术一般选择减数第二次分裂中期的卵母细胞作为受体细胞，其原因有：①卵母细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质；②；③。
（5）高产奶牛“卢辛达”的培育也用到了细胞核移植技术，其过程大致如下图所示：
其中供体细胞来自（填“高产奶牛”或“普通奶牛”），将供体细胞注入去核的卵母细胞的透明带中，通过方法使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞中，体现细胞膜的特点；常用方法激活重组细胞，使其完成细胞分裂和发育。如果要提高重组胚胎的利用率，可对期的胚胎进行分割以获得多个可用于移植的胚胎，暂时不移植的胚胎可用方法保存。
【知识要点复习】（1）“三亲婴儿”的获得涉及“试管婴儿技术”，应属于有性生殖，体外受精技术得到受精卵后需要通过早期胚胎培养技术得到可用于胚胎移植的桑椹胚或囊胚，然后进行胚胎移植。
（2）通过题图分析可知，核移植是将母亲卵母细胞的核移植到捐献者去核的卵母细胞中，所以受精卵的细胞核内含有来自母亲的遗传物质和来自的父亲的遗传物质，而受精卵的细胞质基因几乎全部来自捐献者的去核的卵母细胞。
（3）母亲的红绿色盲遗传病基因可以通过细胞核进入受精卵，所以该技术不能避免母亲的红绿色盲遗传病基因传递给后代，该技术能避免母亲的遗传性视神经病变遗传给后代，因此“遗传性视神经病变”应属于细胞质基因控制的遗传病，即致病基因位于线粒体DNA上。
（4）细胞核移植技术一般选择减数第二次分裂中期的卵母细胞作为受体细胞，其原因有：①卵母细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质；②卵母细胞体积大，便于操作；③卵黄多，营养物质丰富，有利于早期的胚胎发育。
（5）高产奶牛“卢辛达”的培育属于克隆，其中供体细胞为高产奶牛的体细胞，其操作流程如下：
将供体细胞注入去核的卵母细胞的透明带中，通过电刺激方法使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞中形成重组细胞，重组细胞还需通过物理或化学方法（如电脉冲、钙离子载体、乙醇等）激活才能继续分离和发育成重组胚胎。如果要提高重组胚胎的利用率，可对桑椹胚或囊胚期的胚胎进行分割以获得多个可用于移植的胚胎，暂时不移植的胚胎可用冷冻方法保存。
【答案】（1）有性早期胚胎培养（或动物细胞培养）胚胎移植（2）母亲的卵母细胞和捐献者的卵母（3）不能线粒体DNA（或细胞质DNA）（4）②卵母细胞体积大，便于操作③卵黄多，营养物质丰富（5）高产奶牛电刺激流动性物理或化学桑椹胚或囊胚冷冻
四、动物细胞工程和免疫知识的综合命题
例4下图是利用单克隆抗体技术制备三聚氰胺特异性抗体的过程。请据图回答：
（1）单克隆抗体的制备是动物细胞工程中技术的重要应用，该技术依据的原理是，而动物细胞培养依据的原理是。
（2）B淋巴细胞是由动物体内细胞增殖、分化、发育而来，主要参与动物体的免疫过程；单克隆抗体的制备所基于的免疫学基本原理是。
（3）由于三聚氰胺分子量过小，不足以激活高等动物的免疫系统，因此在制备抗体前必须对其进行①过程，下列物质中不适合作协助“扩容”抗原分子的是（）
A.蛋白质B.多糖
C.磷脂D.核苷酸
（4）③过程采用与植物细胞原生质体融合相同的诱导方法有，③过程特有的方法是。
（5）④过程涉及两次筛选，分别筛选出和；单克隆抗体与传统血清抗体相比具有的优点是。
【知识要点复习】（1）单克隆抗体的制备过程是将效应B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，然后经克隆化培养和抗体检测，最后得到单克隆抗体，所以单克隆抗体技术是细胞融合技术的重要应用；动物细胞融合依据的原理是细胞膜具有一定的流动性；动物细胞培养依据的原理是细胞增殖。
（2）B淋巴细胞是由动物体骨髓中的造血干细胞增殖、分化、发育而来的，主要参与动物体的体液免疫；单克隆抗体的制备所基于的免疫学基本原理是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
（3）协助“扩容”抗原分子必须是大分子物质，所以核苷酸作为小分子物质被排除。
（4）植物细胞原生质体融合常用化学方法（聚乙二醇PEG）和物理方法（离心、振动、电刺激）；诱导动物细胞融合的方法有三种，分别是生物方法（灭活的病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）和物理方法（离心、振动、电刺激）。
（5）单克隆抗体制备过程的两次筛选：第一次筛选杂交瘤细胞，第二次筛选产生特异性（抗三聚氰胺）抗体的杂交瘤细胞；单克隆抗体与传统血清抗体相比具有的优点是特异性强、灵敏度高、可大量制备。
【答案】（1）动物细胞融合细胞膜具有一定的流动性细胞增殖（2）造血干体液每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体（3）D（4）化学方法（聚乙二醇）和物理方法（电刺激）生物方法（灭活的病毒）（5）杂交瘤细胞产生特异性（抗三聚氰胺）抗体的杂交瘤细胞特异性强、灵敏度高、可大量制备
五、动物细胞工程和植物细胞工程的综合命题
例5某同学在学习“细胞工程”时，列表比较了动植物细胞工程的有关内容，其中不正确的地方有（）处
植物细胞工程动物细胞工程技术
手段植物组织培养、植物体细胞杂交动物细胞培养和融合、单克隆抗体的制备特殊
处理机械法去除细胞壁胰蛋白酶处理、制备细胞悬浮液融合
方法物理方法、化学方法物理方法、化学方法、生物方法典型
应用人工种子、远缘杂交植株、作物脱毒单克隆抗体的制备、克隆动物培养液
区别蔗糖是离体组织赖以生长的成分动物血清不可缺少，需加一定量抗生素特点植物体细胞杂交技术可定向改造生物的性状单克隆抗体的优点是特异性强、灵敏度高、可大量制备A.3处B.2处
C.1处D.0处
【解析】上表中有两处错误：一处是在植物细胞工程的体细胞杂交技术中去除细胞壁的方法是酶解法，即利用酶的专一性原理，用纤维素酶或果胶酶去除细胞壁；另一处是“植物体细胞杂交技术可定向改造生物的性状”，与传统的有性杂交相比，细胞融合技术的优点在于可以克服远缘杂交障碍，但不能定向改造生物的性状，故B项正确。
【答案】B
六、胚胎工程和减数分裂的综合命题
例6哺乳动物卵原细胞减数分裂形成成熟卵子的过程，只有在促性腺激素和的诱导下才能完成。下图是为获得试管动物记录的某哺乳动物卵子及早期胚胎的形成过程示意图（N表示染色体组数）。请回答：
（1）图中Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ细胞的名称分别为、、；卵裂的细胞分裂方式为。上图中细胞Ⅱ处于细胞分裂后期时染色体数为，细胞Ⅲ处于细胞分裂后期时染色体数为，细胞Ⅳ处于细胞分裂后期时染色体数为。
（2）卵原细胞经两次细胞分裂形成卵子，减数第一次分裂发生在排卵前后，减数第二次分裂发生在过程中。若是体内受精，则受精作用发生的场所是，当观察到卵细胞膜与透明带之间时，说明已经受精，是防止多精入卵的第一道屏障。
（3）试管动物的培育主要包括和两个过程，前者需在获能液或“专门溶液”中完成。
（4）对于试管动物理解正确的是。
A.属于无性生殖
B.属于有性生殖
C.体内发育
D.体外发育
E.运用基因工程技术
F.运用细胞工程技术
【知识要点复习】（1）图中显示卵原细胞经过染色体复制（减数第一次分裂前的间期）成为细胞Ⅱ初级卵母细胞，它在促性腺激素的作用下完成减数第一次分裂，形成细胞Ⅲ次级卵母细胞，次级卵母细胞在减数第二次分裂中期与相遇完成受精作用，继续完成减数第二次分裂形成受精卵，受精卵经过卵裂形成早期胚胎。细胞Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分别为初级卵母细胞、次级卵母细胞和受精卵，卵裂的细胞分裂方式为有丝分裂。处于细胞分裂后期的Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ细胞中染色体数分别为2N、2N、4N。
（2）卵原细胞经历的两次细胞分裂分别发生在：减数第一次分裂发生在排卵前后，减数第二次分裂发生在受精作用过程中；体内受精发生的场所是输卵管，当观察到卵细胞膜与透明带之间有两个极体出现时，说明已进入卵细胞，卵细胞被激活完成减数第二次分裂，排出第二极体；第一个触及卵细胞膜的瞬间，透明带的穿透性立即发生改变以防止多个进入透明带，这叫透明带反应。
（3）试管动物的培育主要包括体外受精和胚胎移植两个过程。
（4）试管动物的培育属于有性生殖，涉及动物细胞培养技术，未涉及基因工程技术，试管动物的发育是将早期胚胎移入母体（代孕母体）子宫内发育，因此是体内发育，所以选BCF。
【答案】（1）初级卵母细胞次级卵母细胞
受精卵有丝分裂2N2N4N（2）受精作用输卵管有两个极体透明带反应（3）体外受精胚胎移植（4）BCF
七、胚胎干细胞的应用综合命题
例7下图表示利用胚胎干细胞（ES细胞）所作的一系列研究。请据图分析回答问题：
（1）过程Ⅰ将胚胎干细胞置于γ射线灭活的鼠胎儿成纤维细胞的饲养层上，并加入动物血清、抗生素等物质，维持细胞不分化的状态。在此过程中，饲养层提供干细胞增殖所需的，加入抗生素是为了，这对于研究细胞分化和细胞凋亡的机理具有重要意义。
（2）上图中的胚胎干细胞（ES细胞）可以从和中分离获取。过程Ⅱ将带有遗传标记的ES细胞注入早期胚胎的囊胚腔，通过组织化学染色，用于研究动物体器官形成的时间、发育过程以及影响的因素，这项研究利用了胚胎干细胞具有的特点。
（3）过程Ⅲ中目的基因导入胚胎干细胞最常用的方法是，将获得的目的基因转入胚胎干细胞前需构建，需要的工具酶有。
（4）过程Ⅳ得到的小鼠畸胎瘤中里面全是软骨、神经管、横纹肌和骨骼等人类组织和器官。实验时，获得免疫缺陷小鼠的方法是，该过程研究的意义在于解决临床上供体器官不足或器官移植后免疫排斥等问题。
（5）克隆转基因小鼠常用的技术手段有、、早期胚胎培养技术和。
【知识要点复习】（1）胚胎干细胞培养时所用的饲养层细胞可以供给干细胞增殖所需的营养物质，加入抗生素是为了防止杂菌污染。
（2）胚胎干细胞（ES细胞）可以从早期胚胎和原始性腺中分离获取；胚胎干细胞具有发育的全能性，通过组织化学染色，用于研究动物体器官形成的时间、发育过程以及影响因素。
（3）将基因表达载体导入动物细胞最常用的方法是显微注射法，在导入前需构建基因表达载体（完成后称为“重组DNA”），需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶。
（4）获得免疫缺陷小鼠的方法有射线照射破坏胸腺法和直接手术摘除胸腺法，这样小鼠就不能形成T细胞，不发生细胞免疫，移植组织细胞就不会被排斥。
（5）克隆转基因小鼠涉及克隆，则涉及细胞核移植技术和胚胎移植技术，该小鼠又是“转基因小鼠”，所以又涉及转基因技术。
【答案】（1）营养物质防止杂菌污染（2）早期胚胎原始性腺发育全能性（3）显微注射法基因表达载体限制酶和DNA连接酶（4）破坏小鼠胸腺（5）核移植技术转基因技术胚胎移植技术
【同步训练】
1.英国科学家维尔穆特首次用羊的体细胞（乳腺细胞）成功地培育出一只小母羊，取名“多利”，这一方法被称之为“克隆”。我国中科院动物所和福州大熊猫研究中心合作，通过将大熊猫的细胞核植入到去核后的兔子卵细胞中，在世界上最早克隆出一批大熊猫早期胚胎，这表明我国的大熊猫人工繁殖技术再次走在世界前列。以下说法正确的是（）
A.在形成早期胚胎的过程中，依次经历了卵裂、囊胚、原肠胚等几个阶段
B.在形成早期胚胎的过程中，尚未出现细胞的分化
C.将兔的早期胚胎分割后，分别植入两只母兔的子宫内，并最终发育成两只一样的兔子，此方法与“多利”的培养本质相同，涉及的技术也完全相同
D.兔子卵细胞质的作用只是激发大熊猫细胞核的全能性
2.下列实践与基因工程的说法不正确的是（）
A.利用DNA探针检测饮用水是否含病毒属于基因工程的运用
B.农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，目的基因的最终插入位置是在染色体的DNA上
C.选择大肠杆菌作为“工程菌”生产的胰岛素并不具生物活性
D.培育转基因抗虫棉用到了细胞融合技术
3.下列关于基因工程技术的叙述，正确的是（）
A.切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列
B.PCR反应中温度的周期性变化是为了配合DNA聚合酶催化不同的反应
C.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因
D.抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达
4.现有两个烟草品种A（Hhrr）和B（hhRr）的花粉若干（两对基因分别位于两对同源染色体上），利用诱导因素促使原生质体融合（只考虑两两融合）。只要有一对隐性基因纯合（rr或hh）时，在光照强度大于800 lx条件下，就不能生长。下列叙述正确的是（）
①实验开始时必须除去不利于原生质体融合的物质②实验中得到A、B花粉之间融合细胞的基因型有6种③要想从融合细胞的培养液中分离出基因型为HhRr的杂种细胞，可在大于800 lx光照下培养，收集增殖分化的细胞团④从理论上分析，将融合细胞的培养液放在大于800 lx光照下培养，有5种基因型的融合细胞不能增殖分化
A.①②④B.①②③
C.②③④D.①③④
5.某农业生态工程基地按照生态和经济规律，对种植业和养殖业进行了优化设计。
（1）通过套种、间种和等技术的应用，使种植的农作物为该生态系统组成成分中的提供更多的食物。
（2）作为生态农业，他们用作物秸秆作饲料发展畜禽养殖，人畜粪便大力发展沼气池，沼渣用来养鱼，卖到市场增加了效益，这个基地运用了生态工程的等原理。
（3）在农业生产中尽量不施用农药，其目的是。
A.减少水土流失B.减少土壤肥力
C.减少环境污染D.减少生物多样性
6.水稻种子中70%的磷以植酸形式存在，植酸易与蛋白质结合排出体外，是多种动物的抗营养因子，而植酸酶可降解植酸。科学家研究发现酵母菌中含有植酸酶，设想将酵母菌的植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程，结合所学知识及相关信息回答下列问题：
（1）图中基因组文库cDNA文库（填“大于”或“小于”），B过程需要的酶是。
（2）为获得大量的目的基因，可以用技术进行扩增，其原理是，该过程中需要以图中的或为模板，所用酶的显著特点是。
（3）植酸酶基因能在水稻体内稳定遗传的关键是，可以用DNA分子杂交技术进行检验。
（4）用限制酶处理载体和目的基因后，用酶处理，能连接平末端的酶，形成重组的基因表达载体，该载体的化学本质是。
7.下图是我国南方开始尝试的农业生态系统的结构模式图，其中利用植物秸秆中的原料生产的燃料乙醇，是一种“绿色能源”，可减少对石油资源的依赖。请据图回答：
（1）生态系统的主要功能是和，从生态学角度分析，人们建立图示的农业生态系统的主要目的是。建立该生态工程所遵循的基本原理主要是（至少答两点）等。
（2）植物秸秆经预处理后，应该利用微生物A所产生的纤维素酶进行水解，使之转化成发酵所需的葡萄糖。若从土壤中分离获取微生物A，应采用具有选择功能的培养基，培养基中的碳源为。
（3）为了提高植物秸秆的利用率，可以利用基因工程对微生物A进行改造，其基本方法是：先用同时切割和，然后用DNA连接酶将上述切割产物连接，构建并将其导入到受体菌中。
8.植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。
（1）理论上，基因组文库含有生物的基因；而cDNA文库含有生物的基因。
（2）将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物乙的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的是否得到提高。
（3）假如用得到的二倍体转基因耐旱植株进行自交，如果子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为，则可推测该耐旱基因整合到了同源染色体的一条染色体上；如果子代中表现为，则可推测该耐旱基因整合到了同源染色体的两条染色体上。
【参考答案】
1.A2.D3.D4.D
5.（1）轮种消费者（2）物质循环再生、整体性（物种多样性）（答出两点即可）（3）C
6.（1）大于逆转录酶（2）PCRDNA复制目的基因Ⅰ目的基因Ⅱ耐高温（3）插入（整合）到染色体上的DNA中
（4）DNA连接T4DNA连接DNA
7.（1）物质循环能量流动实现生态系统内能量和物质的多级利用，提高农产品的产量，减少环境污染（合理地调整生态系统中的能量流动关系，提高能量利用率，减少环境污染）物质循环再生原理、整体性原理、物种多样性原理（2）纤维素（3）同种限制性核酸内切酶
目的基因运载体基因表达载体
干细胞培养技术范文第12篇
干细胞(Stemcell)是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在合适的条件下或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，又称其为“万用细胞”。干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。1998 年Thomson等〔1〕第一次从胚胎中分离培养了人体胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)，并随后发现它能分化为体内几乎所有的细胞后，由此掀起全球范围内的hESC研究热潮。本文对人胚胎干细胞的基本理论以及目前国内外人胚胎干细胞的实验研究和临床应用进行综述。
1 人胚胎干细胞的来源
胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团(Inter cell mass，ICM)或早期胚胎的原始生殖细胞(Embryonic primordial germ cell， EG)，是一大类未分化的二倍体全能干细胞，具有无限增殖、自我更新和多向分化的潜能。1998年，Thomson等〔1〕首次报道在体外受精5 d的人囊胚中成功分离出人类胚胎干细胞(Human embryonic stem cell，hESC)，体外培养维持不分化状态均传代30代以上。同年，Shamblott〔2〕报道了从受精后5～9 w的人胚胎中含有原始生殖细胞的生殖嵴和肠系膜中成功分离培养出5 个多潜能干细胞系，其特征类似于胚胎干细胞，可连续传代且核型稳定。免疫组织化学分析表明其可分化为包括所有3 个胚层的组织。Thomson等和Shamblott分别用人胚胎干细胞和胚胎生殖细胞建立了胚胎干细胞系。Hwang等〔3〕应用体细胞核转移技术方法获得了胚胎干细胞，该方法将来源于供体体细胞的细胞核移植进入去除细胞核的卵母细胞，然后在体外将其培养至胚泡期，分离出胚胎干细胞，并可在体外将其定向诱导分化为各种特定的功能细胞，由这种方法获得的细胞或组织，遗传物质和供体一致，故移植后不会产生免疫排斥反应。
2 人胚胎干细胞的生物学特性
人胚胎干细胞有以下特性：(1)具有分化的多潜能性，在体外可诱导分化出属于三个胚层的分化细胞;(2)具有种系传递功能;(3)具有长期的未分化增殖能力，细胞不仅能分化成各种器官组织，而且能增殖生成新的保持同种性状的 ES 细胞;(4)易于进行基因改造操作;(5)保留了正常的二倍体的性质且核型正常;(6)胚胎干细胞端粒酶活性呈阳性，具有维持端粒长度，保持干细胞增殖能力的重要作用〔4〕。
人类ES细胞在形态和行为上与鼠ES细胞不同，其生长缓慢，往往形成扁平而非球形集落〔5〕，未分化人类ES细胞有典型形态，包括高核胞质比例和多巨核。人类ES细胞表达特征细胞表面标记，如SSEA3、SSEA4、TRA160和TRA181，但不表达SSEA1。人类ES细胞来源于非常早期的胚胎，有正常染色体并能延长增殖，它们表达高水平的端粒酶，没有复制衰老现象，提示这些未分化ES细胞系能无限增殖，有可能培养出无限数量的分化衍生物〔3〕。白血病抑制因子(LIF)能阻止鼠ES细胞分化，使其保持未分化状态，当去除LIF或饲养层细胞，许多类型的ES细胞将自动分化形成与种植后胚胎组织相似的拟胚体，这种球形结构包括3个胚层结构〔6〕。人类ES细胞可分化成各种细胞类型，包括内胚层、神经细胞和肌肉细胞等。当人类ES细胞注入免疫缺陷鼠体内，即形成有多种细胞类型分化的畸胎瘤，包括呼吸上皮和内脏上皮(内胚层);平滑肌、软骨、骨和连接组织(中胚层);神经组织、上皮和毛发(外胚层);及许多未分化细胞类型〔7〕。
3 人胚胎干细胞的建系和培养
3.1 胚胎干细胞的建系 在体外受精(IVF)治疗不孕症的过程中，B超介导下经阴道穿刺获取人卵母细胞，将卵母细胞和精子体外受精后培养至囊胚。然后可用免疫外科手术法、组织培养法、机械剥离法等，去除囊胚外层的透明带，分离出囊胚中的ICM。目前最常用的胚胎是冷冻胚胎，其次是新鲜胚胎、克隆胚胎。
将临床上人工终止妊娠的5～9周龄胎儿，用加有青霉素、链霉素的PBS反复洗涤，剪开胎膜，小心分离出胚胎，在解剖镜下用眼科剪剪取胚胎生殖嵴及周围组织，剪碎，用消化液消化，离心去上清，加入培养液，置于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养。一段时间的培养后，hESC从内细胞团中爬出，经过反复传代，建成hES细胞系。
3.2 胚胎干细胞的培养
3.2.1 常规培养液 常用的基础培养基有改良伊格尔培养基(MEM)α、达氏修正依氏培养基(DMEM)、组织培养基(TCM)199、F12 等合成培养基，以 DMEM应用最为普遍。它的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质。
3.2.2 无血清培养基 血清中含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利于 ESC 未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液〔8〕、化学合成培养液〔9〕进行 ESC的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，实验表明ESC增殖旺盛，且能保持未分化状态，并认为无血清培养基优于血清培养基〔10〕。但也有学者认为含血清培养液更利于胚胎干细胞向中胚层细胞分化，是因为血清中富含中胚层诱导因子，如骨形态形成蛋白(bone morphogenic proteins，BMP)等〔11〕。
3.2.3 饲养层(feeder layer) 饲养层〔12〕培养体系的建立是ESC体外培养建系中最常用的一种技术方法。饲养层细胞经射线照射或丝裂霉素 C 处理后，虽然失去分裂能力，但仍能保持生存，并有同化培养液的能力，为胚胎发育提供一些必需因子，如成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等促有丝分裂因子，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等细胞分化抑制因子，促进其增殖，抑制其分化。目前常用的饲养层有STO、小鼠胚胎成纤维细胞(primary mouse embryonic fibroblast，PMEF)、SNL (G418R 基因和 LIF基因转染的 STO)、HBC5637等。其中 MEF 以其易于取材、抑分化效果好等特点而被广泛应用〔13〕。但Stacey等认为饲养层技术存在多种细胞因子可使ESC的研究及未来的临床应用复杂化〔14〕。使用人源性体细胞作饲养层建立一株无动物源性蛋白污染的细胞系，可能将为今后临床治疗性的应用提供安全的来源。Richards〔15〕等报道流产胎儿皮肤、肌肉细胞、成人输卵管上皮细胞体外培养后均能够支持hES细胞的体外扩增，并且他们使用人血清代替SR或胎牛血清。CHENG〔16〕等报道用人的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells ，MSC)作为饲养层细胞支持hES细胞的生长，经过13代的传代，细胞仍保持hES细胞未分化状态的分子生物学的特征。安世民〔17〕等通过人胚胎干细胞经体内分化获取间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)为人胚胎干细胞提供一种新的滋养层，研究表明来源于hESCs本身的MSCs可以被用来作为支持胚胎干细胞生长并维持其未分化状态的滋养层细胞。
3.2.4 无饲养层培养方法 目前已报道的有三种无饲养层培养方法。(1)Xu 等提出以MEF的条件培养液作为添加成分，辅助以Matrix〔18〕。(2)在培养液中加入TGFβ、LIF及bFGF，辅助以Fibronectin 〔19〕。Carpenter 等〔20〕建立了长期无饲养层培养hESC 的培养体系。该系统以85 % Knockout DMEM 为基础培养基，用15% KnockoutSR 和bFGF 替代血清，在此基础上添加保持未分化和促进hESC 增殖的细胞因子：TGFβ1、LIF 和Fibronectin基质。其中Fibronectin 可以增加细胞与培养皿的黏附，并可通过其受体Integrin 激活一系列信号途径调节细胞的活动，包括细胞的增殖、凋亡和分化等。但与MEF 饲养层上生长的hESC 相比，其增殖和分化潜能均略降低。且SR 含Albumax，是一种富含脂类的牛血清白蛋白，故有待进一步优化。(3)通过使用特异性化学药物激活Wnt信号途径来维持ES细胞在无饲养层条件下的生长〔21〕。近来，Bigdeli等〔22〕报道利用人成纤维细胞来源的培养基，无需培养基质包被培养皿，成功建系，该方法具有大规模生产的能力，可很好的应用于细胞治疗及毒性试验等不同的情况中。 然而这些培养方法是否能够维持hESC长期体外生长而不改变其特性，长期培养过程中是否会更易于产生异常核型的ES细胞，尚有待于观察。
4 人胚胎干细胞的实验研究及临床应用
4.1 人胚胎干细胞的实验研究 人ES细胞具有多向分化潜能，能分化为属于内胚层、中胚层和外胚层范畴的多种类型细胞:包括神经细胞、肝细胞、造血母细胞、分泌胰岛素细胞、心肌细胞、内皮细胞等。人胚胎干细胞定向诱导是指在体外把人胚胎干细胞定向诱导成分化成熟功能细胞，而横向分化则是把一种组织的成体干细胞诱导分化成另一种组织的“干细胞”或功能细胞，不论定向诱导，还是横向分化，它们的共同基础都是干细胞基因表达的调控。定向诱导分化根据hESC在离体条件下可分化出不同胚层的分化细胞这一特点，将hESC 与不同类型的细胞共培养或加入相应的生长因子诱导干细胞定向单一类型的细胞分化。目前，hESC体外诱导分化的模式主要有诱导分化、自发分化和基因调控分化等。大量的研究〔23〕表明转化生长因子(TGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、Wnt家族蛋白 (Wnt families)、成纤维细胞生长因子(FGF)以及全反式维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)和垂体后叶素、维生素C、5氮胞苷等可以促进ESC分化为心肌细胞。Laura等〔24〕将人胚胎干细胞(hESC)体外诱导分化的心肌细胞，培养观察了达3个月，并通过膜片钳等技术来评估其功能成熟情况，以RTPCR来评估编码离子通道的亚基的表达;发现随着体外培养时间的延长，ESC分化的心肌细胞愈接近成熟心肌细胞表型。常静等〔25〕发现与胎儿心肌细胞的共同培养，能诱导人ESCs发生向心肌方向的分化，人ESCs有望成为心肌干细胞移植的细胞材料。Passier等〔26〕采用无血清培养基诱导胚胎干细胞，发现心肌自发搏动的数量较含血清培养增加了24倍，如果在培养体系中加入维生素C，分化效率还可以再提高40%。Maxim等〔27〕发现HESC与骨髓基质细胞或OP9细胞共培养可诱导hESC向造血干细胞分化。Rambhatla等〔28〕观察到，hESC 培养过程中在二甲基亚砜和丁酸钠依次诱导下形成肝细胞。裴海云〔29〕等将人胚胎干细胞在细菌培养皿中悬浮培养7 d，形成囊性拟胚体，接种至包被有Ⅰ型胶原的组织培养皿，以含有地塞米松、胰岛素的条件培养液进行诱导，条件诱导液培养14 d，结果证实人胚胎干细胞经上述方法培养可向肝细胞分化。李彬等〔30〕采用单层贴壁分化的方法在无血清条件下诱导同源饲养层培养的人胚胎干细胞定向分化，得到了高比例的神经前体细胞。这些神经前体细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。人胚胎干细胞来源的神经前体细胞能够模拟体内神经发育的模式，为在体外研究人的神经发育和再生医学奠定了基础。Reubinoff等〔31〕报道，hESC培养过程中加入bFGF、维甲酸和神经生长因子后可形成大量的神经管样结构，并能进一步分化成神经元、星形细胞和少突胶质细胞。Vogel〔32〕将人ES细胞培养至拟胚体(EBs)后，用神经细胞培养基(常规培养神经细胞的培养基)培养，分离出部分分化的EBs在含碱性成纤维生长因子(bFGF)的培养基中培养，最终获得96%表达神经元标志的细胞。Kwon等〔33〕在实验中将TATPDX1融合蛋白转入HESC，从而激活下游靶基因的表达，促进干细胞分泌胰岛素，比较明确的阐明了干细胞向胰岛细胞分化的机制。Kroon〔34〕等将人胚胎干细胞源性胰腺内皮层移植进入大鼠后有效的产生葡萄糖应答内皮细胞，表明人胚胎干细胞有能力产生葡萄糖应答和胰岛素分泌细胞。Tremoleda〔35〕等比较人胚胎干细胞与成体干细胞的体内骨分化能力，结果经过成骨因素予处理的hESC均产生成骨，未经过成骨因素予处理的hESC产生骨与软骨;而未经过成骨因素予处理的hMSC则不形成骨、软骨与脂肪组织，经过成骨因素予处理的hMSC产生骨与脂肪组织。Masakatsu等〔36〕确定了人ES细胞分化为血管细胞成分的过程，从而为血管再生医学奠定了基础。Christian等〔37〕则通过研究得出结论，维甲酸和骨形态发生蛋白两种信号协同，可大大提高人的ES细胞向上皮细胞的直接分化的效率。石伦刚等〔38〕成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化。分化获得的细胞增殖能力强，表达间充质干细胞的特异性标志，并具有多向分化潜能。到目前为止，人类胚胎干细胞被成功诱导分化为造血干细胞、神经干细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、成骨细胞、内皮细胞及滋养细胞等多种细胞，为hESC分化细胞的移植研究与应用奠定了实验基础。同时，国外学者将人胚胎干细胞源性神经祖细胞移植于远端中脑动脉阻塞的大鼠，在移植后的2个月，移植细胞表达神经元标志物且部分改善大鼠的感觉运动功能〔39〕，展现了人胚胎干细胞在移植与再生医学的良好前景。
4.2 人胚胎干细胞的临床应用 hES可诱导分化为多种细胞，如神经细胞、心肌细胞和肝脏细胞等，通过移植取代体内死亡或无功能的细胞提供长期治疗，可为帕金森病、心脏病、青少年糖尿病和白血病和肝脏疾病等多种临床疾病无限量提供细胞移植供体，从而使此类疾病在治疗上发生革命性变化〔40～44〕。Roberto研究表明，随着胚胎干细胞研究的发展，将其诱导分化为成熟的多巴胺能神经元及用来激活自身体内的修复机制，治疗帕金森病是可能的〔45〕。通过hESC建立体外分化模型，建立各种基因改变的hESC，可发现某些基因或细胞因子在胚胎发育早期对不同类型细胞或组织分化的作用，从而研究人类发育早期事件。遗传工程技术的应用，在体外定向改造ESC细胞后，可对胚胎干细胞进行基因改造，将特殊改变的基因转导至胚胎干细胞中，体外选择后将胚胎干细胞导入机体，使胚胎干细胞中的遗传信息传达给子代〔46～48〕，这可能有助于某些遗传性疾病的治疗。还可将胚胎干细胞中某个基因敲除或将外来的某个基因导入，用于研究特定基因对胚胎发育、药物代谢和肿瘤形成的影响，模拟细胞、组织在体内对被试药物及毒素的反应情况，为药物筛选和潜在的毒素筛选提供更安全、廉价的模型。尽管采用干细胞移植治疗疾病的研究取得了较大进展，但离临床应用还存在相当的距离。
5 问题与展望
胚胎干细胞在揭示生命，药物筛选、新药开发，移植治疗及研究胚胎发育和疾病发生和遗传性疾病具有极为广阔的前景〔49〕，但目前尚有许多的问题需要我们去解决，首先，须进一步的改善人胚胎干细胞的分离、培养、建系的工作〔50〕，明确细胞分化的触发与调控机制，掌握体外控制干细胞定向分化技术，控制ES细胞将特定细胞分化的基因和环境信号，将ES细胞定向诱导生成一种特定的细胞及一个复杂的组织或器官，建立更多的hESC系并对其特性进行研究，解决现有的hES细胞仍达不到临床应用的标准、可能存在异源蛋白污染及长期体外培养的hES细胞出现分化比例偏高和基因突变，甚至染色体也会出现非整倍体改变的危险。其次，细胞或组织移植后，可能存在ESC致癌或形成组织瘤问题;胚胎干细胞诱导分化的细胞和组织若用于患者的替代性治疗，存在免疫排斥反应问题，如何克服移植排斥反应是hESC成功应用于临床的前提;体细胞核转移技术所需时间长，对实验室设备要求高以及分化细胞的增殖。因此，只有进一步深入研究，才能为人胚胎干细胞在治疗性药物筛选、临床细胞治疗和组织工程等方面的应用奠定良好的基础。
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干细胞培养技术范文第13篇
多少年来，我们不得不面对这样一个事实：各种各样的牙齿治疗虽然已经被温柔的叫做牙齿美容，可仍然麻烦得让人心有余悸。
想要拥有一口洁白健康的牙齿吗？即使按最流行的治疗方案种上假牙，仍然不是一种理想的解决方案，因为假牙让人很不舒服，就连有"艺术级"水准的钛合金牙也意味着鲜血淋漓而又异常复杂的牙科手术，而且远没有真正的牙齿灵巧方便。
如今，通过生物组织工程学发展的人牙再生技术会在不久的将来轻松解决这些问题。专家预测，如果这项技术能够成功，不管是假牙、牙桥或植牙，都将成为历史名词，未来人们掉牙后能用自己的细胞再生一个和原齿一样的牙齿。而随着技术的成熟，也将会有越来越多的人接受这种牙齿手术。
培育“基因牙” 红透亚欧半边天
一提到生物组织工程学，人们最容易联想到的是像肝脏、肾脏以及心脏之类的重要脏器，而牙齿似乎可另当别论。
然而，有许多研究人员认为，目前生物组织工程学一些最激动人心的进展就是在牙科领域创造的。
进展公报一：和天然牙一样能向大脑传递信息
日本日立公司医学研究小组宣布：它们将继乳牙、恒牙之后，研究开发与正常牙齿功能完全一样的基因牙。他们会先大量培养患者智齿附近的牙齿干细胞，然后制成齿胚，在牙模型里培育成牙齿，最后植入拔牙后留下的牙床空穴。通常的假牙没有咀嚼反应，不向大脑传达刺激信息，而“基因牙”和天然牙一样能向大脑传递信息。
进展公报二：让患病牙齿在原来位置的组织上进行再生
据《新科学家》杂志报导，英国伦敦Paul Sharpe教授利用基因干细胞培育方法让老鼠成功长出了"定制"的牙齿。这项实验证明了牙齿干细胞的存在。Paul Sharpe教授表示将会进一步利用基因疗法使患病或是腐烂的牙齿再生，最终目标是促使口腔内患病牙齿在原来位置的组织上进行再生。
进展公报三：牙科手术中将可以使用在试验室培养出来的牙齿
美国得克萨斯州大学健康科学中心的MaryMacDougall博士在接受BBS采访时表示："科研人员现已利用实验鼠的干细胞培育出鼠牙，这证明可以在培养皿中制造牙齿，不管是门牙还是臼齿，它们可以提供给医生在临床中使用。这一成果如成功运用在人身上，将解决目前牙病患者因戴假牙而产生的各种不适应症问题。”他进一步预测，十年之内在牙科手术中人们将可以使用在试验室培养出来的牙齿。
让“基因皓齿”成形的几个化学信号
“基因牙”的培育运用了生物组织工程学中的定向分化技术，原理是人为干预干细胞或祖细胞(这两种细胞可以分化为体内不同种类的器官组织)的分化方向，使这些细胞不再分化成为完整的个体，而是按照我们的需要分化成单一的组织或器官。
用干细胞分化成牙之所以成为生物组织工程学的一个很诱人的目标，是因为牙并不像肝脏或心脏那样是维持人体存活所必须的脏器，即使培育的牙没有按我们预想的那样在牙床上正常排列也不要紧，牙科大夫只要将它取出来再重头做一次即可。此外，将生物组织工程学处理过的细胞植入牙齿缺损的部位无需太大的手术，只需要我们都熟悉地"张开嘴，啊......"就好了。
但是，实际上要做到这一点却并不那么容易，从细胞发育成牙齿必须依靠一系列复杂且相互联系相互影响的化学过程，这些都是受基因调控的，只有能够掌控让这个化学过程顺利进行的一系列化学信号才是成功的关键。
化学信号一：釉细胞
我们的牙齿是由几种成分组成的，其中包括坚硬的牙本质及其外面的一层薄薄的白色牙釉质。别小看它，这可是我们身体里最坚硬的物质。牙齿的发育要靠牙龈的上皮细胞和其下的间充质细胞之间的相互作用引发，间充质细胞中有可以长出形成牙本质的细胞，称之为成牙质细胞；而上皮细胞中则有长出形成牙釉质的细胞，称之为成釉细胞。
化学信号二：髓室
在每一颗成熟的完整牙齿中，都有一个叫做"髓室"的小腔，其中填塞着从牙龈延伸而来的丰富血管和神经。
化学信号三：干细胞
最近，科学家发现在每一颗牙的髓室中都含有能够转化成牙质细胞的干细胞。研究者从人类牙齿中抽提出牙髓质，用酶将其降解，再将降解产物置于培养皿中进行培养。他们发现许多细胞在这个过程中死亡，但是却有一些细胞存活下来并不断生长分化，它们就是干细胞。在一个髓腔的上百万细胞中，大约只有80个这样的干细胞。科学家将干细胞与牙本质的矿物质部分进行混合，并将它们种植于小鼠的皮下，借此来模拟成牙质细胞在牙龈上皮细胞下的正常生存环境。两个月后，已有一些细胞转化为成牙质细胞，甚至还有一些干细胞形成了富含血管和神经的髓样组织。这证明牙再生在理论上是可能的。
化学信号四：UNX2基因
科学家从一种"锁骨头颅骨发育不良"的奇特遗传病中发现了UNX2基因，他们发现患上这种病的人虽然骨发育都有不同程度的畸形，但却会长出额外的牙齿，而所有这些都源于一个被称为UNX2基因的单点基因突变，说明这一基因在人体生长的早期对骨骼发育起着至关重要的作用。
关于“基因牙”的世界争论
日本：牙齿的再生是可能的
很多理由足以让我们相信，牙齿的再生是可能的。例如，许多低等脊椎动物可以不断地长出新牙，更有甚者，一些种类的鲨鱼一生中可以长出数千颗牙。虽然哺乳动物已失去了这种能力，但是一些患上特殊遗传病的人却能够长出额外的牙来。而且，与牙有类似基本构成物质的骨骼在受伤后可以再生，这证明我们的身体有这种潜能，那为什么牙齿不能做同样的事呢?理论上，我们要做的只是加大机体在这方面的能力。
中国：通过基因技术诱导出类似牙根的组织是一次飞跃
口腔修复治疗涉及到口腔生理、生物力学和美学方面的要求，目前还难以想象基因工程能随心所欲地“建造”人体最精密最坚硬的器官组织。如果能通过基因技术诱导出类似人牙根的组织结构，供口腔修复医师作为基牙进一步完成缺损缺失牙列的修复，对口腔医学来说就是一次飞跃。
美国：通过牙龈注射基因试剂诱导牙齿再生将需要更长时间
虽然科研人员已在老鼠实验中发现了至少25种与牙齿再生有关的不同基因，证明了牙齿干细胞的存在，但毕竟只能确保十年之内在牙科手术中可使用上在试验室中培养的牙齿。要想通过给牙龈注射基因试剂从而诱使人体重新再生牙齿，则将需要更长的时间。
干细胞培养技术范文第14篇
【关键词】骨髓基质干细胞；髋关节；软骨缺损；组织工程
关节软骨损伤修复是骨科学研究的热点，组织工程技术的出现为关节软骨损伤的治疗提供新思路。目前常用的研究方法为在体外培养扩增种子细胞，在体外与生物材料结合后直接植入体内修复关节软骨缺损[1]。我们通过组织工程技术在体外构建组织工程软骨，并应用于修复兔股骨头关节软骨损伤，现报告如下。
1 材料与方法
1．1 实验动物 3月龄健康新西兰大白兔16只，雌雄对半，体质量2．1～3．4 kg，购自上海中科院实验动物中心。
1．2 主要实验仪器和试剂 CO2培养箱（HERA），超净工作台（苏州净化设备厂），倒置显微镜（Olympus），DMEM培养液、0．25%胰蛋白酶、细胞因子TGF-β、b-FGF（Sigma），小牛血清（杭州四季青生物公司），Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒（北京中杉生物公司），RNA提取试剂盒（QIA），RT-PCR试剂盒（晶美生物公司），组织细胞染色（本院病理科提供），生物材料胶原膜由中科院生物医学工程研究院提供。
1．3 实验方法
1．3．1 骨髓基质干细胞的获取 可取自两侧髂棘，用16号骨髓穿刺针抽取骨髓2 ml，针筒内预先置入1 ml DMEM培养液（含肝素1 000 U），以3∶7的比例加入淋巴细胞分离液，以2 000 r/min，15 min离心，吸取中间单个核细胞层，再用DMEM培养液冲洗3次，血球计数板计数。
1．3．2 骨髓基质干细胞培养 按15×105/ml细胞浓度培养，培养液DMEM培养基含小牛血清12%、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml，培养条件为5%CO2、37℃、饱和湿度，培养3 d后更换所有培养液，以后隔天换液1次至细胞单层融合，应用0．25%胰酶消化获得第一代骨髓基质干细胞用于诱导分化实验。
1．3．3 骨髓基质干细胞诱导分化 取上述细胞，加入含25 ng/ml TGF-β、2 ng/ml b-FGF和12%小牛血清的DMEM诱导分化培养液，2 d换液1次，7 d传代1次，获取第3代细胞作为本研究实验细胞。
1．3．4 体外组织工程化软骨的构建 取上述细胞悬液进行浓缩，密度为2．5×107/ml，滴注到胶原膜上，4 h后缓慢加入诱导分化培养液，3 d半量换液1次，维持培养2周后用于检测及体内实验。
1．3．5 体外构建组织工程软骨特性检测 取上述构建的组织工程软骨福尔马林固定、石腊包埋、切片，HE染色，阿新兰染色，RT-PCR进行Ⅱ型胶原基因表达检测。
1．3．6 股骨头关节软骨缺损模型制作与组织工程修复 1%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，常规消毒铺巾，取兔髋关节外侧纵形切口，切开髋关节外侧肌群，暴露髋关节关节囊，“T”切开关节囊，手法致髋关节脱位，暴露股骨头，用环钻人为造成股骨头负重区直径约3 mm、深约3 mm关节软骨缺损，取上述构建的组织工程软骨，交替植入一侧软骨缺损区为实验组，相应的另一侧不作任何处理为空白对照组或单纯用胶原膜修复为材料（实验组16个缺损，空白对照8个缺损，材料对照8个缺损）。手法复位，认真缝合髋关节关节囊及各层组织，术后让动物自由活动，于8、16周后处死动物，取髋关节软骨缺损修复情况。
1．3．7 组织学检查 取修复组织福尔马林固定后，脱钙后石腊包埋、切片、HE染色，Ⅱ型胶原免疫组化染色，观察修复结果。
2 结果
2．1 骨髓基质干细胞分离与培养 分离的细胞在培养第2天开始出现细胞贴壁生长，呈纺缍形、多角形、短梭形，细胞增殖旺盛，8 d后长满培养瓶，在倒置显微镜下细胞形态一致。
2．2 组织工程化软骨的特性 经诱导分化培养2周后胶原膜与细胞复合体体积变化不明显，质地仍较软。HE染色显示复合体内细胞呈梭形，未见明显软骨陷窝，RT-PCR可检测出Ⅱ型胶原基因有较强的阳性表达，阿新兰染色显示细胞周围基质强阳性着色。
2．3 大体标本 术后全部动物自主活动良好，伤口愈合好，未见明显感染,术后8周取大体标本观察，见修复组股骨头负重区关节软骨缺损处有白色软骨样组织修复，缺损填充平整；术后16周关节软骨缺损仍为白色软骨样组织修复，部分见表面粗糙；两对照组未见修复，见明显关节软骨缺损区。
2．4 组织学观察 术后8周HE染色片光镜下见修复组修复组织为透明软骨样组织，厚度接近正常，与周围软骨面结合好，表层细胞为梭形成纤维样软骨细胞，中下层以圆形透明软骨样细胞为主，可见呈柱状排列，与软骨表面相垂直，软骨陷窝清晰可见，与底层软骨下骨连接良好；术后16周软骨陷窝仍清晰，但镜下可见软骨细胞排列紊乱。对照组为明显缺损区，部分为纤维样组织修复。
2．5 组织化学染色与免疫组织化学染色 对修复组织切片后进行阿新兰染色，见细胞周围基质被染成深蓝色，Ⅱ型胶原免疫组化染色显示修复组织中细胞的细胞质和细胞外基质Ⅱ型胶原强阳性表达；对照组纤维样组织Ⅱ型胶原免疫组化染色阴性。
3 讨论
关节软骨组织工程构建的基本原理是在体外培养扩增获得大量软骨细胞，与可吸收材料结合塑形后植入体内代替损伤的软骨组织，近年来的研究发现软骨细胞在体外扩增极易产生去分化现象，从而失去软骨细胞表型，不是理想的种子细胞[2]。
骨髓基质干细胞是一种多能干细胞，已证实其在特定条件下可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞甚至神经元细胞，但是在骨髓中骨髓基质干细胞的含量极低，需要大量的骨髓才能获得足够细胞量[3]。而且我们前期的实验已证实经过大量传代后骨髓基质干细胞仍保持分化成软骨潜能，应用含25 ng/ml TGF-β、2 ng/ml b-FGF和12%小牛血清的DMEM培养液可将骨髓基质干细胞成功诱导分化为软骨样细胞[4]。
细胞在体外培养时易产生接触抑制从而影响细胞的生长和功能，本研究中应用的多孔胶原膜可以为骨髓基质干细胞提供生长和增殖空间，有利于细胞的营养摄取和物质交换，阿新兰染色和基因检测显示所构建的组织有特异性Ⅱ型胶原和酸性粘多糖（GAG）表达，符合软骨组织特性。本研究结果显示在修复后8周关节软骨缺损修复良好，但16周后部分关节出现不同程度的退行性改变，其可能的原因是骨髓基质干细胞在体外的诱导培养时间过长，从而失去干细胞的某些特性，改善培养环境及条件是继续研究的方向。
参考文献
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干细胞培养技术范文第15篇
1990年，诺贝尔生理学或医学奖授予给了美国医生J.E默里和E.D托马斯，因为他们在医学史上的重大贡献――发明一种治疗疾病的新方法，即细胞和器官移植。
毋庸置疑，器官和细胞移植是2。世纪生物医学工程领域中具有划时代意义的技术。它是人类改变传统药物治疗方式，使衰竭器官恢复功能的一种新医疗模式，为医学领域带来了革命性变化。2013年，世界卫生组织调研显示，全球一年实施了近12万例器官移植手术。尽管无数病患因此获得了新生，但令人忧心的是，这一数据仍只能满足不到10%移植等待者的需求。并且，对于器官移植和捐献领域起步较晚的我国而言，器官需求数量与供给数量的比例更加触目惊心。
不过，科学家正在探寻新的方法，有可能在不久的将来，这一现状就将得到革命性的变化。
除了公民自愿捐赠器官外，需要器官移植的病患或许又多了一种新选择――选取自身的一点皮肤细胞，通过干细胞再造器官技术挽救自己的生命。为了这一梦想，昆明理工大学灵长类转化医学研究院教授李天晴，多年来不断开拓创新、勇攀高峰，带领团队开展的灵长类多功能干细胞全能性研究取得了重大进展，为无数重病患者带来了生的希望。
梦之源起――瞄准多功能干细胞研究
干细胞即为起源细胞，是一类具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力，在一定条件下能够产生高度分化的功能细胞，医学界称之为“万用细胞”。人类对干细胞的研究被认为开始于20世纪60年代。在几个近亲种系的小鼠畸胎瘤的研究中，表明其来源于胚胎生殖细胞。此工作确立了胚胎癌细胞是一种干细胞。
1998年，美国威斯康星大学教授詹姆斯，汤姆森利用人的胚胎建立了世界第一株人类胚胎干细胞系。而正是由于人胚胎干细胞系的建立才产生了再生医学的概念，使干细胞研究显示其巨大的应用价值，受到人们的广泛关注。
21世纪初，当新千年的钟声敲响，还在中国科学院昆明动物研究所读博士的李天晴，开始跟随导师展开了灵长类干细胞的研究之旅。在意识到干细胞研究领域的无限发展前景后，2005年，博士毕业的李天晴就顺理成章地留在了所里当了助理研究员。然而，随着研究的日益深入，他也渐渐感觉到知识和研究手段的缺乏。为此，在2006年10月，李天晴毅然前往美国进行干细胞的博士后研究。并于2017年年底归国，投入了干细胞与再生医学的海洋。
一直以来，将人类胚胎干细胞投入医学应用的障碍之一，正是在于它们极其具有前景的一个特征――天生能够快速分化为各种类型的细胞。直到现在，科学家们仍然无法回答的一个重大科学问题是：灵长类（包括人）干细胞是否具有原始态的特性，即能嵌合到早期胚胎并产生嵌合体。这已经成为制约干细胞临床应用的关键性科学问题之一。
然而，人多能干细胞（PSCs）与大、小鼠相比，表现出不同的特性以及调控机制。实验表明，小鼠的胚胎干细胞容易在体外保持它们的原始态、未触发状态，而人类胚胎干细胞则很难在体外保持这种状态。根据发育阶段、克隆形态、信号依赖、线粒体代谢、嵌合能力、基因表达以及表观遗传等差异，哺乳动物干细胞多能性被分为原始态（Naive）和始发态（Primed）两种状态。Naive多能干细胞具有更好的体内分化发育能力，相似于囊胚前的早期胚胎卵裂球。当其注射到早期胚胎后，能够参与胚胎的发育和分化，产生嵌合体动物，再生功能的组织器官，而Primed多能干细胞这样的功能相当有限。
同大小鼠相比，人的胚胎干细胞研究存在的最大问题就是没有一个统一的标准来衡量干细胞的多能性。传统的体外分化和畸胎瘤等方法，只能对干细胞的分化能力进行定性分析，不能回答所有与人类多能性相关的问题，诸如人类多能性细胞是否具有正常的体内发育能力、这些已分化的细胞被移植后是否仍保持原来的细胞命运、这些细胞是不是会无控地增殖和迁移等。
由于缺乏统一的评价标准，导致不同实验室建立的人ESC（胚胎干细胞）、iPSC（诱导多功能干细胞）差异很大，在基因表达以及分化倾向性方面存在较大差异，阻碍了干细胞的临床应用。而由于小鼠ESCs具有Naive（原始态）特性，因此不同ESCs系之间的基因与分化能力差异较少，预示了获得NaivePSCs是干细胞实现临床转化的关键条件之一。
然而，目前仅小鼠和大鼠上具有这种Naive PSCs。如何建立人的NaivePSCs以及干细胞的鉴定标准，仍是干细胞基础研究和临床应用需要解决的一个重大科学问题。这也是李天晴一直以来奋斗的目标。
由于理和条件的限制，无法直接在人类干细胞检测其多能性。猕猴或食蟹猴作为与人类亲缘关系很近的非人灵长类，在解剖、生理、遗传，特别是在神经系统结构与功能上如认知、情绪、和社会行为等方面，表现出与人类的高度相似性。因此，猴被认为是多种人类神经系统类疾病唯一或最合适的实验动物模型。更为重要的是，猕猴或食蟹猴与人类的PSCs极为类似，而与啮齿类动物的PSCs差异巨大。利用灵长类疾病动物模型，建立干细胞治疗疾病的技术标准和规范，促进干细胞在体内的安全性和有效性，将实现干细胞的临床转化。
同时，作为人类起源与发展的关键和核心地区之一，素有“动物王国”“植物王国”和“有色金属王国”之美誉的云南，拥有丰富的灵长类资源。1965年，距今约170万年的元谋人被发现于云南元谋县上那蚌村西北小山岗上。这是迄今为止发现的亚洲最早人类。
2014年，在多年的灵长类研究基础上，昆明理工大学灵长类转化医学研究院成立。成立之初，便以建成国际一流的灵长类转化医学研究院为目标，通过产学研结合，促进以非人灵长类动物作为技术平台的生物医学技术研究及其产业化应用。通过多学科交流与融合，结合中心自身的优势条件，目前，研究院已开辟了干细胞与再生医学等多个不同的研究发展方向，拥有干细胞培养、分离、分化以及鉴定等所需的各种大型仪器和实验条件。其依托下的云南中科灵长类生物医学重点实验室，下设灵长类生殖与发育生物学实验室、灵长类干细胞与再生医学实验室、灵长类神经生物学实验室、病理实验室、灵长类动物实验和质量控制实验室以及中心实验室等，拥有丰富的灵长类资源的得天独厚的地域和技术储备优势，依托灵长类等实验动物养殖和动物实验研究体系，开展灵长类生物医学和人类重大疾病的灵长类动物模型相关的基础和应用基础研究。
正是得益于云南省丰富的灵长类资源及世界一流的人类重大疾病灵长类动物模型研究技术和平台，从2002年起，李天晴就在灵长类干细胞的科研之路上不断攀登，并取得了多项重大突破：首先在国际上建立了猴子胚胎干细胞的同源饲养层培养以及猕猴胚胎干细胞定向分化为功能神经干细胞的体系；同时，通过长期的探索研究，他们还创造了干细胞领域里程碑式的成果――首次在世界上分离了原始态的灵长类干细胞，并证明这些细胞能够产生嵌合体猴。这是第一次在世界上证明，高等动物的干细胞可以产生嵌合体动物。梦之基石一一“嵌合体猴”的诞生
在古希腊神话中，有一只脾气十分暴虐的怪兽奇美拉（Chimera）。它长着狮子的头，蛇的尾巴，背上还有一个会喷火的羊脑袋……这便是世界上最早出现的嵌合体动物。
简单来讲，所谓嵌合体就是指由不同基因型的细胞所构成的生物体。而嵌合体动物，就是将一个动物的胚胎干细胞注射到另一个动物的囊胚当中，随后通过辅助生殖技术而获得的产物。1907年，德国植物学家和遗传学家㈠温克勒把嵌合体比喻为希腊神话中狮首、羊身、蛇尾的奇美拉神兽，这也是嵌合体外文名Chimera的由来。
随着技术的发展，目前，科研人员已经通过胚胎干细胞嵌合成功的嵌合体动物只有小鼠和大鼠。嵌合体的形成是评价干细胞Naive特性的金标准。然而，灵长类多能干细胞是否能够产生灵长类嵌合体，一直是个世界性难题。2012年，美国Oregon国家灵长类中心的Shoukhrat等人在Cell杂志上发表文章表明，培养的猴PSCs不具有嵌合体产生的能力。
那么，灵长类多能干细胞究竟能否产生嵌合体动物呢？
尽管一次次试验、一次次失败，李天晴团队依旧坚持不懈。面对外界不断传出的否定理论，他和研究队伍不为所动，一心沉浸在自己的实验世界中。最后通过改良的培养条件，他们改变了食蟹猴胚胎干细胞（cESCs）的生长特性、基因表达谱和维持自我更新的信号通路，将cESCs转化为Naive-like cESCs（由于不清楚这些细胞能否在四倍体补偿的条件下产生干细胞猴，因此李天晴团队把他们称为Naive-like细胞）。当这些细胞注入桑椹胚后，形成嵌合体囊胚。之后，李天晴团队又将15个嵌合体囊胚移植到5只母猴体内，有2只成功怀孕。3个多月后，为了检测各种组织器官的嵌合情况，他们对两只胎儿终止了怀孕过程，检测到两只胎儿成功实现了嵌合，而这两只采用的是同一种干细胞处理技术。
随后，研究人员检测了3月龄猴子的心脏、肾脏、胰脏、大脑、脾脏、肺、肝脏、、皮肤等18个器官，都检测到了经过标记后的干细胞。这样，就证明了嵌合进去的干细胞整合到了胚胎中，参与了机体各种器官的发育并分化成各种组织细胞。
2015年7月2曰，李天晴团队的这一成果成功发表在国际一流期刊Cell StemCell杂志上。论文一经发表后便引起了巨大关注。李天晴团队的研究，首次在世界上证明了利用灵长类ESCs获得嵌合体猴是可行的，同时也证明了灵长类动物胚胎干细胞的全能型，具有重大的科学和应用价值：1、为建立灵长类（包括人）PSCs的鉴定标准提供了重要参考；2、实现对体内组织器官的再生，为最终体内再生功能器官用于病人器官移植提供重要的研究基础；3、结合基因定向修饰技术，建立人类特定疾病的非人灵长类动物模型。
在器官移植领域，早在一百多年前，国内外一些科研人员就开始研究异种器官移植。1905年，法国进行了世界第一例异种器官移植手术，把兔肾脏植入肾功能衰竭儿童体内，手术很成功，但16天后由于排异反应，这名儿童死于肺部感染。
为了减少异种移植中的排异反应，科研人员尝试敲除供体的某些基因，取得了一些研究进展，但还没有完全突破。
而嵌合体猴的研究，则希望用另一种方式解决排异反应。将灵长类动物中的食蟹猴作为研究对象，利用它的胚胎干细胞成功获得嵌合体猴。理论上，通过此胚胎干细胞生长出来的各项组织器官与原来的食蟹猴应当是一致的，将嵌合体猴的器官移植到原来的食蟹猴中，就很好地解决了异种移植带来的排斥反应。
如果研究不断获得进展，在大量再生器官的安全性和功能性评价基础上，未来还可以用病人自身的皮肤细胞，经过重新程后成为全能干细胞，然后将全能干细胞注射到猪或其他动物的胚胎中去再生出病人自身的器官，最终为挽救病人的生命做出贡献。
一分耕耘一分收获。李天晴团队坚持不懈的努力也为他们带来了丰厚的回报。2016年2月，该研究成果被评为云南省2015年的十大科技成果；李天晴本人也因此被中国干细胞生物学分会授予“干细胞青年研究员奖”。同时，以色列威兹曼科学院的国际著名多能干细胞研究专家Jacob Hanna也对他们的工作进行了高度评价，认为具有里程碑意义。
梦之锻造――在奋斗中前行
产生“嵌合体猴”究竟意味着什么？撇开这项技术在国际干细胞领域产生的极大影响，对于李天晴而言，“目前，这个工作仅仅是宏伟目标的一小步，意味着还有很多工作要做”。
作为新的医学革命，以干细胞治疗为核心的再生医学，已成为继药物治疗、手术治疗后的另一种疾病治疗途径。然而，大多数类型的干细胞，缺乏对干细胞治疗的安全性和有效性方面的科学评估。因此，利用与人高度相似灵长类疾病动物模型，建立干细胞治疗神经疾病的技术标准和规范，促进干细胞在体内的安全性和有效性，即促进干细胞临床转化，是李天晴的另外一个梦想。然而，干细胞临床前研究需要解决以下几个重大的问题：1）干细胞的规模化培养，满足临床的大量需求；2）将PSCs定向分化为高纯度特定的、安全的功能细胞；3）促进功能细胞在体内的存活和功能的重建。
为了解答这些问题，李天晴团队又展开了一系列研究计划。
首先是实现了多能干细胞的可规模化培养。干细胞的规模化培养是干细胞领域的一个比较关键性的技术，传统的采用二维的培养方法无法满足临床和药物筛选的大量需求。为此，李天晴团队设计了一套简单的三维悬浮培养体系，通过细胞筛，将人和猴子的多能干细胞切割成大小均质的团块，通过悬浮培养为均质的细胞球，并通过细胞筛切割进行连续传代。采用这种简单的方法，团队实现了人和猴PSCs的长期传代，并保持干细胞的多能性。5天内干细胞可以实现19倍的扩增，其增值速度是二维培养体系下的2-2.5倍，该培养体系不仅简单，而且容易进行规模化培养，目前已经获得国家专利的批准。
并且，在神经干细胞、特定神经细胞培养以及分化等方面，李天晴团队也建立了一系列成熟的系统：建立了单个神经上皮干细胞的扩增系统和神经疾病与发育的研究系统，可以促进对神经管发育的理解，并进而开发为治疗神经系统的细胞产品；首次证明人多能干细胞高效分化为功能的、可移植的人大脑皮层投射神经元，该体系为干细胞治疗脑损伤以及为研究CfuPNs（皮层投射神经元）和中间神经元发育的典型细胞模型。
为了实现个性化医疗和精准治疗，避免移植后的免疫排斥反应，传统的方法是将病人的体细胞重编程为iPSCs细胞，然后再分化为特定的细胞，但由于iPSCs的低效率以及安全性问题，阻碍了其临床转化。为此，李天晴团队开发了灵长类成纤维细胞直接转分化为功能端脑神经上皮干细胞的体系，通过体系的改进将猴子成纤维体细胞直接转化为iNESCs（神经上皮干细胞），为干细胞的个性化医疗和精准治疗提供了重要的研究基础。
同时，他们还建立了3D条件下可规模化诱导人和猴多能干细胞定向分化为心肌细胞。干细胞治疗需要大量的细胞，如心肌梗死等需要大约1x109的细胞数量。同样，采用二维的分化体系，很难获得足够的心肌细胞。为了解决这个问题，李天晴团队设计了一个三维的培养体系。该体系是在三维培养多能干细胞的基础上进行的，整个培养体系非常简单、无生长因子，全部采用小分子物质进行。并且，由该体系培养出来的心肌球具有正常心肌细胞的超微结构、钙波、成熟基因的表达谱和对药物的反应，可以作为一个药物的筛选平台。进一步研究发现，三维条件下产生的心肌细胞比二维条件下产生的心肌细胞具有更好的成熟功能。而该系统则非常适合规模化生产心肌细胞用于疾病的研究、细胞的治疗和药物的筛选。目前为止，相关的培养体系以及培养基已经申请国际专利，获得了PCT授权，并进入了美国和中国的专利申请阶段。
而在细胞治疗和神经细胞再生方面，李天晴团队也取得了多项突破，发现了成年动物的视网膜里存在干细胞，这些干细胞通过体外纯化后，在体外能无限扩增，并分化为七种不同的视网膜细胞。在合适的分化条件下，视网膜干细胞能够分化为高纯度的感光细胞，移植到rdl突变的视网膜色素炎和rd7突变的夜盲症的疾病动物的视网膜后能够整合到视网膜，分化为视网膜感光细胞，并与体内的双极细胞建立功能链接，恢复对光的感应能力，具有重大的临床转化价值。
此外，神经干细胞在小鼠脑内能够很好整合，但在灵长类动物脑内的整合仍然是一个难题。通过长期的攻关探索，李天晴团队成功地建立了神经上皮干细胞（NESCs），为了探索移植治疗，将NESCs在移植前分别进行了几种不同方法的分化，并分别将这些分化的细胞移植到成年猕猴的大脑皮层以及纹状体部位。结果表明，不同分化条件下的细胞都能整合到大脑中，并分化为成熟神经元。但它们之间的整合能力存在显著性差异。研究还发现，细胞的整合能力与细胞移植的位置具有重要的关系，如相比大脑皮层，NESCs更容易整合到纹状体：而皮层的白质区域不利于细胞的存活。这些平台和工作的建立，不仅多是原创性的工作，更为重要的是，这些NESCs移植到猴子的脑部后，能够整合、迁移并分化为神经元和星型胶质细胞，并表达特异的神经递质，为下一步干细胞治疗奠定了重要的基础。
梦之起航――从胰腺移植开始
2016年4月，世界卫生组织报告称，全球糖尿病患者人数已经从1980年的1.08亿增加到2014年的4.22亿，而且世界上有8.5%的成年人均患有糖尿病。同时，由于我国人口基数大，人口老龄化加剧以及饮食结构等因素，导致我国糖尿病患者人数约1.1亿人，位居世界第一。
糖尿病是由于胰腺细胞的胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。近年来，随着患病人数的激增，需要通过胰腺移植治疗糖尿病及其并发术的病人也与日俱增。目前，在各种器官移植中，胰腺移植已经成榻龃斡谏觥⒏卧嘤胄脑嘁酝猓占第4位的器官移植。然而，目前我国每年约有15。万人因末期器官功能衰竭需要进行器官移植，但最终只有1万人完成了器官移植手术。如果采用传统的器官捐献方法，根本无法获得足够的胰腺器官数量。
为此，李天晴团队以前期工作为基础，目前又开展了“利用灵长类多能干细胞体内再生胰腺器官”项目研究，以期通过对干细胞体内再生胰岛组织器官关键性技术的突破，建立灵长类动物的体内再生组织器官的技术平台，为最终再生人类器官提供重要的研究基础。
Pdx1基因是胰腺早期发育的一个关键基因，其缺失将导致胰腺发育的缺陷。2010年，日本东京大学丁Kobayashi等人将小鼠的多能干细胞注射到Pdxl基因（即缺失Pdx1基因）的小鼠胚胎，l现出生小鼠的胰腺来自注射的Naive多能干细胞，并且将大鼠Naive多能干细胞移植到Pdx1基因小鼠的早期胚胎，在小鼠体内能够再生大鼠的胰腺，实现了多能干细胞在同种动物间以及异种动物间胰腺器官的体内再生。其后，日本学者Kato Seiji Usui等人采用该方法将小鼠Naive多能干细胞注射到Sall1的小鼠胚胎（肾脏发育缺陷的胚胎），发现多能干细胞再生了小鼠的肾脏，实现了多能干细胞体内再生肾脏器官。这些突破性的研究结果表明Naive多能干细胞具有再生体内组织器官的能力，而组织器官的再生关键在于是否存在具有良好嵌合能力的多能干细胞。
以往的研究表明，当灵长类干细胞被注射到猴子早期胚胎后，发现细胞并不能有效地嵌合到猴的胚胎中，产生嵌合体猴，因此不具有器官再生的能力。
好在，这些技术瓶颈问题在前期的研究基础中已经被李天晴团队有效克服了。
2015年，李天晴团队在世界上首次分离的能够产生嵌合体猴的Naive猴子多能干细胞，在嵌合到猴子胚胎里后能伴随胚胎在体内的发育，分化为机体内的各种组织细胞。其中，胰腺在所有的组织器官中，表现了较高的嵌合率。重要的是，Naive干细胞在胰腺分化为外分泌腺细胞和胰岛细胞，其中分化的胰岛细胞包括β细胞、α细胞以及胰岛前体细胞。该技术的突破，为体内构建灵长类的组织器官奠定了重要的技术基础。
同时，李天晴团队所在的云南中科灵长类生物医学重点实验室，还于2013年利用目前世界最新的基因组编辑技术CRISPR/Cas9和TALENs，实现了猕猴和食蟹猴两个物种的靶向基因修饰，首次在世界上建立了基因敲除的猴模型。
因此，在“利用灵长类多能干细胞体内再生胰腺器官”项目中，李天晴团队选择了胰腺组织作为研究的突破口，结合目前已经建立的灵长类动物基因敲除猴技术，通过TALEN等技术，敲除受体猴的胰岛器官发育的关键性基因PdX1，阻止胚胎细胞发育为胰腺器官，然后将具有嵌合能力的Naive猴多能干细胞注射到Pdx1基因的猴胚胎里面，利用干细胞在体内对胰腺发育的补偿作用，实现胰腺组织器官体内的再生；在此基础上，通过优化细胞的注射时间、注射的细胞数量以及注射后胚胎的体外培养等方式，研究影响胰腺器官再生的一些因素。
