绿色荧光标记检测范文

1材料和方法

1.1材料

台式低温高速离心机、台式冷冻离心机和PA800毛细管电泳仪（BeckmanCoulter公司）；MiniVE垂直电泳系统（GEHealthcare公司）；原核表达质粒pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP（分别由广东省蛋白质组学重点实验室郭爱华和陈腾祥构建）；大肠杆菌菌株DH5α（本室保存）；质粒纯化试剂盒（U-Gene公司）；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）由Calbiochem公司生产；microconYM-10超滤浓缩装置（Millipore公司）；TALONMetalAffinityResin（BDBioscienceClontech公司）；透析袋（Merck公司）；人单核细胞系THP-1（香港大学医学院徐爱民教授惠赠）；无内毒素的RPMI-1640培养液和胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）由Hyclone公司生产；proteaseinhibitorcocktail（sigma公司）。

1.2方法

1.2.1质粒pET14b/MCS-EGFP和pET14b/EGFP-hCRP的原核表达

用pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP分别转化BL21（DE3）大肠杆菌菌株，各挑取3个克隆到5mlLB培养液（Amp+）中，37℃振荡扩增，当菌液OD值约为0.4时，加入5μl100mmol/LIPTG到5ml的菌液中，室温振荡4h，取1ml菌液3000r/min离心5min，加入200μl1倍SDS上样缓冲液重悬沉淀，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察蛋白表达情况。各取表达目的蛋白的克隆1ml加入到200mlLB培养液（Amp+）中，按上述表达条件进行大量诱导表达。

1.2.2His-EGFP蛋白的纯化

按TALONMetalAffinityResin试剂盒说明书，配制结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。200ml转化了质粒pET14b/MCS-EGFP的大肠杆菌经室温诱导4h后，4℃8000r/min离心菌液10min，用4ml冰冷的结合缓冲液重悬细菌沉淀，超声波裂解，4℃12000r/min离心20min，取上清加入到装有TALONMetalAffinityResin的纯化柱中，按操作说明进行亲和色谱纯化。洗脱得到的纯化蛋白用Bradford方法定量。

1.2.3His-EGFP-CRP蛋白的纯化

配制缓冲液A（50mmol/LTris-HCl、0.5mmol/LEDTA、50mmol/LNaCl、5％甘油、0.5mmol/LDTT，pH7.9）。200ml转化了质粒pET14b/MCS-EGFP-CRP的大肠杆菌经室温诱导4h后，4℃8000r/min离心菌液10min，用10ml含5％TritonX-100缓冲液A重悬沉淀，超声波裂解细菌，4℃12000r/min离心20min。沉淀（主要为包涵体和细菌碎片）转入5ml的玻璃匀浆器内，加入10ml含5％TritonX-100的缓冲液A充分匀浆沉淀，室温静置20min，匀浆液离心后取沉淀重复匀浆洗涤1次。加入10ml含3％十二烷基肌氨酸钠（SKL）和0.3％十二烷基硫酸钠（SDS）的bufferA，充分重悬沉淀，静置60min以缓慢溶解包涵体。溶解产物4℃12000r/min离心20min，取上清加入到microconYM-10中，超滤浓缩到原体积的1/2。然后加入到TALONMetalAffinityResin的纯化柱中，进行亲和色谱纯化。洗脱得到的纯化蛋白用Bradford方法定量。

1.2.4SDS-PAGE检测质粒原核表达和蛋白纯化情况

分别取少量未转化质粒的BL21（DE3）、诱导表达的转化子、转化子菌液裂解后的离心沉淀物及上清、亲和纯化的洗脱液，加入SDS上样缓冲液，进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色观察蛋白表达和纯化情况。

1.2.5蛋白质重折叠复性及缓冲液置换

上述亲和纯化得到的His-EGFP和His-EGFP-CRP蛋白液分别加入到截留分子量为10kD透析袋中，放入到500ml含0.5mmol/LDTT的BufferA中，4℃透析12h，每3h更换透析液；将透析袋放入另一个500ml的透析体系（含1mmol/LGSH、0.2mmol/LGSSG和0.6mmol/LL-精氨酸的PBS）中，4℃透析12h，每3h更换透析液；最后放入500mlPBS溶液中，4℃透析3h，重复4次。用0.22μm的滤膜过滤除菌，Bradford方法定量，分装后贮存于-80℃。

1.2.6荧光蛋白的高效毛细管电泳检测

分别取纯化后的His-EGFP和His-EGFP-CRP的蛋白样品，用PBS将浓度稀释为100mmol/L，按操作说明加入到毛细管电泳仪PA800的专用样品管内以备进样检测；检测器选用激光诱导荧光（laserinducedfluorescence,LIF）模组，检测波长为488nm；毛细管柱为N-CHO内涂层的石英毛细管，内径50μm，总长度为50.2cm，从进样端至检测窗口的长度为40cm；采用真空抽吸进样，压力为2psi，进样时间10s，电泳电压为20kV，进样端设置为正极，检测端为负极。分别使用pH值为7.0、6.0、5.0、4.0、3.0的电泳缓冲液（0.1%Tween20，100mmol/L四硼酸纳）对上述2种样品进行分离检测。

1.2.7细胞培养及His-EGFP-CRP结合活性检测

THP-1用含10%FBS的RPMI-1640在CO2培养箱（37℃，5％CO2）中培养。细胞培养至1×1010个/L时，取5ml细胞培养物于25℃1000r/min离心5min，弃上清，用细胞裂解液（10%甘油、50mmol/LHepes-KOH、100mmol/LKCl、0.1%NP-40、2mmol/LDTT、10mmol/LNaF、0.25mmol/LNaOVO3、50mmol/Lβ-甘油磷酸）1ml、10μlproteaseinhibitorcocktail重悬沉淀，4℃静置1h后，4℃14000r/min离心20min。离心上清中分别加入His-EGFP和His-EGFP-CRP的蛋白样品（终浓度为100mmol/L），混匀后于37℃静置30min，加入的样品管中，按上述参数进行高效毛细管电泳检测。

2结果

2.1pET14b/MCS-EGFP和pET14b/EGFP-hCRP的原核表达及其蛋白纯化

如图1A所示，与未转化质粒的BL21（DE3）相比较，转化了pET14b/MCS-EGFP的感受态细菌经IPTG于室温诱导后，在约30kD分子量处出现了一条特异性条带，与His-EGFP的理论分子量（约29kD）接近，表明诱导表达成功；菌液经超声裂解后，离心得到的沉淀和上清中均检测到高丰度的His-EGFP蛋白，说明His-EGFP的可溶性很好，但由于表达量很高，部分蛋白也可能在形成的包涵体内。经过金属Ni离子亲和色谱法纯化后，结果显示获得的目的蛋白纯度和回收率均很高。

如图1B所示，pET14b/EGFP-hCRP转染感受态BL21（DE3）并诱导后，在约50kD处出现1条表达量不是很高的特异性条带，与His-EGFP-CRP的理论分子量值接近，说明诱导表达成功；菌液经超声裂解后，沉淀中可检测到大量的His-EGFP-CRP蛋白，而上清中几乎检测不到相应的条带，提示原核中表达的His-EGFP-CRP溶解性很差，基本以包涵体的形式存在。包涵体经过洗涤、溶解后释放出His-EGFP-CRP，经亲和色谱法纯化，得到纯度较高的目的蛋白，回收率低于His-EGFP的纯化。

2.2His-EGFP和His-EGFP-CRP样品HPCE检测

如图2A和2B，当电泳缓冲液pH为7和6时，His-EGFP和His-EGFP-CRP的分离检测效果很差，几乎没有荧光信号被检测到；当pH值小于或等于5时，可以检测到波长为488nm的绿色荧光信号，随电泳缓冲液pH逐渐减小，信号峰的峰宽也逐渐减小，峰高增加。His-EGFP的检测为单峰，提示His-EGFP的结构形式较为单一；而对于His-EGFP-CRP，pH值为5时，可检测到2个峰，分辨率较低；pH值为4和3时，可检测到3个峰，说明该蛋白的结构形式有多样性。

2.3His-EGFP-CRP结合活性检测

对加入了His-EGFP的细胞裂解物进行HPCE，除了在5～9min处有一些微小峰外，其分离图谱与单纯的His-EGFP样品检测没有明显差异（见图2A和图2C）。相对于单纯His-EGFP-CRP样品检测，加入了His-EGFP-CRP的THP-1裂解物的分离图谱出现了明显的改变，3～7min处峰群的峰高和峰面积明显减少，在8～13min处出现了新的峰群，以电泳液pH为4时最为明显（见图2B和2D），提示His-EGFP-CRP与某些细胞分子结合成为复合物，从而使其延迟时间发生了改变。

3讨论

通过基因重组进行质粒构建、原核诱导表达、蛋白纯化和复性的探索，拟为深入研究CRP内化入胞机制和胞内功能提供研究工具。在表达纯化的探索中，发现原核表达的人CRP重组蛋白的溶解性很低，基本上以包涵体形式存在，利用高浓度的尿素和盐酸胍等变性剂溶解包涵体的效果不佳，通过多次摸索，利用SKL、TritonX-100、SDS等去污剂和二硫键还原剂DTT增加了溶解包涵体和重组蛋白的能力，用金属离子亲和色谱方法获得较纯目的蛋白，在氧化还原体系GSH/GSSG和L-精氨酸条件下，通过缓慢降低去污剂的梯度透析方法对纯化的蛋白质进行复性处理。

蛋白质复性后，利用HPCE技术对重组蛋白的一般理化性质和结合活性进行检测。分离模式采用区带毛细管电泳（capillaryzoneelectrophoresis,CZE），同时电泳液中加入少量（低于胶束浓度）的非离子型去污剂（Tween20）以减少蛋白质在管壁上的粘附。在这种分离模式下，带正电荷的蛋白质由正极向负极迁移，并在负极端用LIF模组检测，带绿色荧光的蛋白质通过时可被检测。结果发现，当电泳液pH≤5时，方可检测到His-EGFP-CRP的荧光信号，因此提示融合蛋白His-EGFP-CRP的等电点（pI）接近于6，该蛋白质在低于其pI的溶液中带正电荷，易于在该电泳模式下分离检测。His-EGFP的检测结果与His-EGFP-CRP相近，表明2种重组蛋白pI接近。

与His-EGFP的单峰相比较，His-EGFP-CRP的检测出现多个峰，可能原因是复性后His-EGFP-CRP以多种结构形式存在。CRP阅读框由2个外显子和1个内含子组成，编码含187个氨基酸的单体蛋白［1］。在血浆、组织液和细胞内，CRP的结构形式具有多样性：有分子量为21kD的单体形式，也有由5个相同的单体（亚基）以非共价交联的方式聚合成五角型盘状结构，还有研究发现单体可以聚合成为纤维状的结构［6］。这些结构的多样性在一定程度上可以解释CRP功能的多样性。本工作构建的融合蛋白是在CRP的3’端挂上EGFP和his标签，要使其能应用于CRP功能和内化机制的研究，其前提条件之一是增加的EGFP和his氨基酸序列不能影响CRP的结合活性。HPCE的结果显示复性后的His-EGFP-CRP可能存在单体和多聚体的结构形式，提示CRP的聚合特性没有受到His-EGFP影响。至于His-EGFP-CRP的多聚体结构形式，还需深入研究。

已有研究表明CRP能够与小核核糖体蛋白、组蛋白、层粘连蛋白、磷酸胆碱和磷酸乙醇胺等细胞内或细胞膜上的分子物质结合［1，7］。为了解His-EGFP-CRP是否具有CRP的结合活性，将His-EGFP-CRP与单核细胞THP-1的裂解物进行孵育结合，HPCE结果发现His-EGFP-CRP的检测峰增多了，提示His-EGFP-CRP与细胞裂解物中的一些分子结合形成了复合物；而单独的His-EGFP仍然为单峰，并没有形成复合物，说明His-EGFP-CRP结合活性是由其中的CRP部分所产生的，His-EGFP不影响其结合活性。本研究表明表达纯化及复性的CRP融合蛋白虽然在3’端增加了His-EGFP序列，但是仍然保留CRP的结合活性，可以用于CRP胞内功能和内化机制的研究。