小议基因芯片在医学研究中的运用范文

1基因芯片技术概述

1.1基因芯片的分类。

1.1.1按储存的生物信息类型分类寡核苷酸芯片、cDNA芯片、PCR扩增子探针芯片,这是最常用的分类方法。寡核苷酸芯片探针长度较短,一般为几十个碱基,是通过采集已知基因组序列,经过特殊的探针设计和分析软件筛选,用DNA合成仪人工合成,常用于基因分型和突变检测;cDNA芯片是通过逆转录获得基因的编码区片段制备成的芯片,主要用于基因表达分析;PCR扩增子探针芯片是通过分析已经测序的目标基因组上的保守或特征性的基因或DN段,设计扩增引物,进行PCR扩增,将获得的长度为几百至上千个碱基左右的扩增子作为芯片探针,常用于基因表达的分析。1.1.2按应用不同分类可分为表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片。1.1.3按基片的性质分类可分为有机芯片(聚内烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜)和无机芯片(玻璃、硅片、陶瓷)。1.1.4按材质和功能分元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片。近年来,基因芯片技术应用于miRNA(microRNA)的研究有了重要突破[4,5]。miRNA是一些长度为22个核苷酸左右的非编码调控RNA家族。miRNA具有同源性、保守性及特异性等特点,通过影响蛋白质的合成参与调节生物细胞的发育。但是,miRNA只是总RNA样本中的一小部分,只能为添加标记或设计探针提供很少的序列,用高特异性来标记比较困难。同时,miRNA以3种方式存在:小的成熟miRNA、发夹状的miRNA前体、长的miRNA前体。只有成熟的miRNA是有活性的,因此,需要剔除miRNA前体。用标准的芯片程序去分析miRNA比较困难。

1.2基因芯片制备分析方法。

1.2.1杂交样品一般从样品细胞和对照细胞中提取。1.2.2cDNA微阵列探针制备提取的mRNA通过反转录得到更稳定的cDNA,分别对样品细胞和对照细胞中加入不同荧光染料(Cy3,Cy5)进行标记。1.2.3杂交试验2种样品同时杂交到制作好的芯片上,芯片上每个点都与分别标记有2种不同荧光的样品竞争结合。1.2.4扫描与杂交结果分析通过激光扫描仪获得每个点Cy3与Cy5的荧光强度,用软件分析其荧光强度值并计算Cy3与Cy5的比值。2个荧光信号的强度代表2种标记探针的相对数量,比值代表该点对应基因的mRNA在2种细胞中的表达丰度。1.2.5微阵列系统核实与差异表达基因判定实验中设置阴性、阳性对照点,以确保整个微阵列系统杂交结果的可信度,重复实验以降低假阳性率;差异基因的判定标准为Cy3与Cy5的比值在0.5~2.0之间。

1.3基因芯片技术的应用领域。

1.3.1临床疾病诊断。基因芯片技术可以对遗传信息进行准确分析,快速找出差异基因,因此它在疾病诊断方面发挥着越来越重要的作用[6,7]。1.3.2药物筛选和新药开发。用基因芯片技术确立了疾病组与对照组相关基因表达的差异情况后,就可针对疾病发生机制进行药物筛选:将这些差异基因固定在芯片上,研究病变组织和正常组织在某种药物刺激下这些基因表达的变化,从而判断药物治疗的效果,并通过高通量筛选,为新药的开发提供一种高速、高敏的方法。1.3.3DNA测序。将已经被荧光标记的待测DNA样品与设计在基因芯片上的已知序列片段杂交,若两者完全配对,则杂交信号较强,若有一个或几个碱基不配对,则信号较弱。目前基因芯片在DNA测序方面的应用主要是用于已知序列的重测序[4]。1.3.4环境科学领域。基因芯片可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害,同时也可以采用毒物检测芯片对环境中众多化学物质对人类基因的潜在毒性进行筛选,探测毒物开启或关闭哪些基因,制备防治危害的基因工程药物,或寻找能够治理污染源的基因产品[8]。另一方面,基因芯片技术在病毒检测、劳动卫生学、食品卫生学、农林畜牧业也发挥越来越大的作用[9,10]。1.3.5转基因食品安全性的应用。将特异片段制成检测芯片,与待测产品的DNA进行杂交,就可以判断待测样品是否为转基因产品,该技术不仅可对转基因食品进行定性检测,还可以定量检测。

2基因芯片技术在男性生殖医学研究中的应用

基因芯片技术在男性生殖医学研究和临床应用中具有广泛的前景[1,2,7]。目前,主要见于精子发生基因研究、精子功能研究、生殖毒理研究以及男性不育的诊断和治疗的研究。

2.1在精子发生基因研究中的应用精子发生是一个独特复杂的细胞分化过程,其表达受严格的时间和空间调节,任何影响精子发生的因素都可能导致精子发生异常。因此精子发生的基因研究是生殖生物学领域中的一个重要课题。Tang等应用基因芯片筛检Balb/c小鼠出生后不同时期睾丸的cDNA文库[11],结果表明ACRV1在出生后35d、54d和6个月的小鼠睾丸中表达,而在4d、9d和18d的小鼠睾丸中未表达,并确定ACRV1仅在小鼠出生后35d的睾丸组织中特异表达。通过荧光免疫检验法和免疫组织化学染色显示[11],人类ACRV1蛋白主要位于睾丸的圆形精子细胞和长形精子细胞中,表明ACRV1在哺乳动物的精子发生过程中起着重要作用,并且可能会成为避孕疫苗的靶点。近年来相关研究报道[12-17],利用基因芯片技术发现了NYD-SP12、NYD-SP6、NYD-SP9、NYD-SP16、Rtn-T、CLGN等睾丸表达基因,这些基因编码的蛋白都与精子的发生密切相关。Sha等应用cDNA微阵列技术筛查成人和胎儿睾丸组织的基因表达[18],发现一种新的睾丸特异基因TSP1,蛋白分析显示其包含N-末端的bHLH和C-末端的Zip的2个功能区域,在成人睾丸中高表达,提示对人精子发生发挥重要作用。Zhou等利用同样的研究方法发现了一种新的基因TSG23/Tsg23[19],并通过RT-PCR、原位杂交、蛋白质印迹及免疫组织化学等方法验证了TSG23/Tsg23主要位于睾丸组织。此作者还比较了正常生育男性和无精子症患者睾丸中TSG23的表达,结果显示,梗阻性无精子症患者睾丸中TSG23的表达少于正常生育力男性,而在非梗阻性无精子症中则无表达。因此TSG23/Tsg23可以为无精子症的诊断和分类提供参考,也预示着TSG23/Tsg23与人精子发生有关。当精子发生基因出现突变或表达异常,或调控的时间及空间异常,就可能导致少精子症,甚至无精子症。

应用基因芯片技术,可以对无精子症、少精子症进行分子病因学诊断,并可以进行大样本快速准确的遗传学筛查。Y染色体上存在大量与精子发生相关的基因,其中在其长臂非荧光区域(Yq11,23)有一个无精子因子(azoospermiafactor,AZF)基因位点,由于该基因缺失患者多数表现为无精子症,所以称为AZF基因[20]。AZF基因缺失导致男性不育的遗传因素中排第2位,仅次于Klinefelter综合征,AZF分为AZFa、AZFb、AZFc、AZFd等4个区域,其中以AZFc的缺失较多见(60%)[21-23]。Zhu等对中国178例非梗阻性无精子症、134例少精子症不育男性和40例正常生育男性进行Y染色体检测[24],结果显示11.5%(36/312)不育患者中存在Y染色体微缺失,其中AZFc微缺失所占比例最大(52.8%);正常生育男性中未检测到Y染色体微缺失。目前检测Y染色体微缺失的技术灵敏、高效,建议对此类患者在实施辅助生殖技术前进行Y染色体遗传学筛查。cDNA微阵列技术可以应用于筛选非梗阻性无精子症相关基因的研究。Lin等通过cDNA微阵列技术筛查9例生精功能正常者和15例精子成熟障碍或唯支持细胞综合征患者的睾丸组织样本[25],结果后者共有300个基因显著下调,并且证实其中10个是与生育相关的新基因(Hs.126780、Hs.553658、Hs.274135、Hs.268122、Hs.531701、Hs.171130、Hs.351582、Hs.407480、Hs.552781、Hs.355570),大部分新基因在鼠和人类睾丸中的表达是特异性的,将为人类精子发生的研究提供新途径和方向。杨波等应用微阵列芯片对10例正常人睾丸及39例非梗阻性无精子症睾丸组织中差异表达基因谱进行了研究[26],获得128个可能与无精子症相关的差异表达基因,其中56个基因表达上调,72个基因表达下调,COX10下调明显,原位杂交技术结果与cDNA微阵列杂交相同,说明COX10可能在无精子症的发生与进展过程中起重要作用。杨波等还应用基因芯片技术研究了RAP1A、钙黏附分子CDH18、PCDH17、细胞周期类分子在人无精子症患者和正常生育男性睾丸中的差异表达[27-29],结果表明这些基因可能与睾丸精子发生和无精子症存在相关性。Lian等通过微阵列技术比较非梗阻性无精子症(non-obstructiveazoospermia,NOA)患者和正常生育力男性睾丸组织中miRNA的表达谱[30],结果表明,NOA患者有154个miRNA表达上调和19个表达下调,这些表达异常的miRNA通过RT-PCR进行了验证,包括miR-302a、miR-491-3p、miR-520d-3p和miR-383。

2.2在精子功能研究中的应用精子发生的基因突变或表达异常,也可能导致精子的功能异常,发生弱精子症,甚至死精子症。Yap等使用RNA原位杂交表明[31],MII5表达于鼠的生殖细胞中,同时通过电子显微镜、视频显微镜和体外受精等技术证实,缺失MII5的鼠其精子成熟末期和包装存在缺陷,这与MII5的表达一致,这些缺陷包括顶体帽的分离和过多残余胞质,导致精子功能异常,前向运动精子数减少。这些缺陷通过体外受精无法改善,基因芯片技术分析结果表明,MII5转录产物与精子发生有关。Montjean等收集男性不育患者和正常生育男性的精液样本[32],经非连续密度梯度离心法分离出精子,基因芯片技术分析表明,在精子样本中探查到5382个基因,少精子症不育组和正常生育组的精子转录表达具有高度同源性。另外,与正常生育组相比,有157个转录基因在不育组中表现为上调或下调,这些差异基因涉及一系列的生物过程和分子功能,下调至少2倍的调节基因在不育患者生殖细胞中占大约83%,其中涉及精子发生、精子活力、生殖细胞抗凋亡程序的基因(PRM2,SPZ-1,SPATA-4,MEA-1,CREM)下调高达42.96倍;表达下调的基因还涉及DNA修复(NIPBL)、氧化应激调控(PARK7)和组蛋白修饰(DDX3X,JMJD1A)。李如凯等应用基因芯片技术将纯化的精子cDNA探针与Affyme-trix全基因组芯片杂交[33],结果C14orf48基因在弱精子症患者精子中不表达,此外对人的8种组织(心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、睾丸)进行C14orf48检测,结果C14orf48只在睾丸组织中表达。研究结果提示[33],C14orf48基因为睾丸特异性表达基因,其在弱精子症患者精子中不表达,提示其表达水平的缺失可能在弱精子症中起重要作用。

2.3在男性生殖毒理中的研究生殖系统对金属,尤其是镉(Cd)、铅(Pb)、汞(Hg)、铬(Cr)、锰(Mn)等重金属及其化合物的作用非常敏感,金属对生殖系统的毒性存在剂量-效应关系,当毒性达到一定程度可能导致不育。将青春期鼠在不同剂量的Cd环境中暴露不同时间,然后观察其精子的活力,利用cDNA微阵列分析睾丸基因表达情况,结果显示当睾丸长期暴露于低剂量的Cd环境中,精子活力随暴露时间延长和剂量增加而降低,钙调节基因的转录和L型电压依赖型钙通道mRNA连接体的表达发生改变,而涉及调节精子活力的钙连接蛋白并没有受到影响[34]。Cheng等将TM4大鼠的Sertoli细胞放在1mmol/L的CrCl3中培养7d后提取mRNA[35],然后与芯片杂交,结果表明,Cr可能是通过对睾丸Sertoli细胞的调控而影响精子的发生。让小鼠分别每日喂服1000mg/kg大黄素和50mg/kg丙烯酰胺,连用5d,然后应用cDNA微阵列和qPCR技术对2种药物作用于睾丸后的基因表达差异进行比较分析,结果显示2种药物均可降低睾丸生精功能、改变嗜酸性粒细胞并使生殖细胞凋亡,对睾丸是有毒性作用[36]。

3总结

近年来,男性不育的发病率逐年上升,但是约30%~40%的生精功能异常病因不甚明了,此时基因改变可能是这些疾病的重要原因[37-39]。基因芯片技术的不断完善和应用,能为男性不育病因诊断提供先进的研究手段。目前,基因芯片技术的研究存在一些难点,比如基因序列信息缺乏、探针的合成与固定比较复杂、实验室操作标准化问题、费用过高和专利限制等,尚需要进一步研究。

作者：陈冠培赵永平金玲丽单位：浙江省宁海妇幼医院北京大学人民医院生殖医学中心