成骨细胞内质网应激特征范文

《上海医学杂志》2015年第六期

内质网是细胞内重要的细胞器，其功能损伤可以引起内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERS）。ERS是细胞内一种适应性机制，可以影响成骨细胞的功能和分化，持续或过强的ERS如果不能恢复则会诱导细胞凋亡，从而导致各种骨细胞相关性疾病发生。因此，ERS在骨生物学中的作用日益受到重视。将成骨细胞的ERS与骨发生进行联合研究有助于病理情况下骨生物学的研究，对于骨病的发生、诊断和治疗均可提供理论依据。本研究将能引起成骨细胞ERS的公认化学物衣霉素作为受试物，采用骨发生PCR芯片（包含碱性磷酸酶、骨钙素、胶原酶家族、骨形成蛋白家族、整合素家族等与骨发生相关的84个基因）技术，观察受试成骨细胞的成骨发生表达情况。

1材料与方法

1．1实验材料衣霉素购自美国Sigma公司，RNA提取试剂盒（RNeasyPlusMiniKit）、第一链合成试剂盒（RT2FirstStrandKit）、荧光染料（RT2SYBRGreenqPCRMastermix）、PCR芯片（未折叠蛋白反应PAHS－089ZA－2和骨发生PAHS－026ZA－2）均购自德国Qiagen公司。

1．2细胞培养原代培养人成骨细胞由钟近洁教授赠送［4］，以2．5％的Ⅱ型胶原酶消化引产胚胎四肢长骨，建立原代培养人成骨细胞，经过骨结节和碱性磷酸酶鉴定。人成骨细胞在含10％FBS的DMEM培养基于37℃、体积分数为0．05的CO2培养箱中进行贴壁培养，每2～3d根据细胞生长的密度和培养液酸碱度的变化更换培养液，当细胞汇合度达到80％时进行传代培养。

1．3PCR芯片检测衣霉素先溶于DMSO中配制成50mg／L储备液，临用前配制成应用液。根据之前的实验结果应用0和2mg／L衣霉素干预人成骨细胞24h后，提取RNA。应用NanoDrop分光光度计测定其浓度，琼脂糖凝胶电泳测定其RNA完整性。取400ngRNA反转录合成cDNA，采用PCR芯片（RT2ProfilerPCRArray）进行荧光定量检测，将cDNA模板适当稀释后加入实时荧光定量PCR反应混合液中，然后在含有基因特异性引物的96孔板各孔中加入等量反应液，于荧光定量PCR仪（EppendorfMastercyclereprealplex2）上进行实时定量PCR反应。计算每张PCR芯片中每一基因的每个反应管内荧光信号达到设定域值时所经历的循环数（Ct值）。每个处理组重复用PCR芯片测定3次。采用ΔΔCt方法比较相应基因的表达量变化，表达量差异在2倍以上者为差异有意义基因。

2结果

2．1RNA电泳结果可见18S和28S两条带，且28S条带的亮度是18S条带的两倍，鉴定结果显示样品RNA无明显降解，符合芯片检测要求。

2．2芯片测定的质量控制基因组DNA控制显示无基因组DNA污染，反转录控制和阳性PCR控制显示RNA纯度高，完全能满足实时荧光定量PCR的要求。

2．3未折叠蛋白反应通路检测结果表达上调的基因有39个：ATF4、ATF6、CALR、CANX、CEBPB、CHOP、DERL1、DERL2、DNAJB9、DNAJC10、DNAJC3、DNAJC4、EDEM1、PERK、IRE1α、IRE1β、ERO1L、ERO1LB、ERP44、HERPUD1、HSPA1L、HSPA2、BIP、MANF、NUCB1、OS9、PDIA3、GADD34、RNF139、RPN1、SEC63、SEL1L、SELS、SERP1、SYVN1、UGGT1、USP14、VCP、XBP1。无基因表达下调。各基因的功能分类：诱导内质网相关性降解的基因包括CALR、CANX、DERL1、DERL2、NUCB1、OS9、SELS、SYVN1，表达差异倍数分别为5．7120、3．0293、2．7492、4．2693、2．0763、2．5123、3．8879、7．1552；未折叠蛋白结合的基因包括DNAJB9、DNAJC10、DNAJC3、DNAJC4、UGGT1，表达差异倍数分别为19．8216、2．9980、13．5855、2．1273、2．9160；内质网蛋白质折叠的质量控制基因包括EDEM1、RPN1、SEC63、ERP44，表达差异倍数分别为5．1480、2．2799、3．1580、3．2021；翻译调节基因为SERP1，表达差异倍数为5．042；泛素化基因包括HERPUD1、RNF139、SEL1L、USP14，表达差异倍数分别为24．7439、2．1273、11．8680、2．0835；转录因子基因包括ATF4、ATF6、CEBPB、CHOP、XBP1、IRE1α、IRE1β，表达差异倍数分别为2．9980、2．0195、3．4919、77．3860、3．0084、9．9108、2．4267；凋亡相关基因包括GADD34、PERK、MANF、VCP，表达差异倍数分别为8．6278、5．1124、12．8973、2．1871；热休克蛋白基因包括HSPA1L、HSPA2、BIP，表达差异倍数分别为2．5036、2．0980、27．1711；蛋白质二硫键异构化基因包括ERO1L、ERO1LB、PDIA3，表达差异倍数分别为3．2021、14．6619、3．7947。

2．4骨发生信号通路检测结果表达上调基因有10个：ALPL、COL10A1、COL15A1、FGF2、ITGAM、MMP10、SMAD1、SP7、TGFB2、VEGFA。表达下调的基因有5个：COL1A1、COL3A1、TGFB3、TGFBR2、NOG。各基因的功能分类：胶原家族基因包括COL10A1、COL15A1、COL1A1、COL3A1，表达差异倍数分别为2．7094、3．1449、0．3116、0．1495；整合素α家族基因为ITGAM，表达差异倍数为2．3916；基质金属蛋白酶（MMP）家族基因为MMP10，表达差异倍数为2．3262；血管生长因子（VEGF）家族基因为VEGFA，表达差异倍数为2．0534；钙离子结合与稳定基因为FGF2，表达差异倍数为5．2525；成骨细胞分化基因包括NOG、SP7，表达差异倍数分别为1．6742、2．2548；转录因子基因为SMAD1，表达差异倍数为2．9959；成骨作用基因包括ALPL、TGFB2、TGFB3，表达差异倍数分别为3．1016、2．7473、0．4724；生长因子和受体基因为TGFBR2，表达差异倍数为0．4642。

3讨论

各种危险因素能改变内质网压力感受蛋白肌醇需要酶1（inosi－tolrequiringenzyme1，IRE1）、蛋白激酶受体样内质网激酶（proteinkinasereceptor－likeERkinase，PERK）和激活转录因子6（activatingtranscriptionfactor6，ATF6）等的表达和活性，诱发ERS［6］。内质网通过激活未折叠蛋白反应保护由ERS所引起的细胞损伤，恢复细胞功能，包括暂停早期蛋白质合成、内质网分子伴侣和折叠酶的转录激活、内质网相关性降解（ER－associateddegradation，ERAD）的诱导。

荧光定量PCR芯片是目前较为简单实用的检测基因表达的方法，能够一次性检测84个与未折叠蛋白反应相关的基因在mRNA水平上的表达，结果无需再进行实时荧光定量检测，具有灵敏度高、特异性强、扩增效率高、均一性好的优点，可同时研究信号通路上的大量基因，有效避免单个基因研究的盲目性。本研究利用这一技术研究衣霉素作用下成骨细胞ERS和骨发生信号通路，有利于较完整地了解这两方面的变化情况。ERS以内质网分子伴侣（BIP）等表达增多和ERS特异的转录因子CHOP（又名GADDl53）表达明显上调为主要特征。从本实验PCRArray检测结果可见，ERS标志性基因BIP和CHOP表达水平均升高，证实了ERS的存在。ERS时PERK信号途径为PERK→EIF2A→ATF4→CHOP，在本研究中以上4种基因表达均上调，显示ERS时该通路充分被激活。ERS时IRE1途径为IRE1→XBP1→CHOP，ATF6途径是与IRE1共用下游的XBP1，后者的下游可以为CHOP，本研究中这两种信号通路上的基因表达均上调。综合以上数据，显示衣霉素诱导成骨细胞ERS，且3条信号途径均被激活。

在衣霉素的作用下成骨细胞发生ERS同时也促进凋亡相关基因表达上调，如典型的ERS信号分子CHOP表达上调。此外，在本研究中衣霉素还激活了一些凋亡相关基因，如果细胞不能正确、及时处理未折叠蛋白反应，成骨细胞将进入凋亡阶段。当成骨细胞发生ERS后，对成骨细胞的骨发生功能也产生影响，主要是损伤了成骨细胞骨化、分化和胶原的合成等功能。其中SP7与ALPL在成骨ERS时处于高表达已经获得证实。而SMAD1和TGFB2等基因表达上调，提示TGFB1信号通路与ERS信号通路可能存在交集。COL1A1表达下调，表明合成胶原受损。而MMP10属于基质溶解素类，降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白，以及纤维连接蛋白和层粘连蛋白等，与破骨细胞活动密切相关，还参与了血管的发生和骨的重塑等，其高表达表明骨转化过程中破骨、溶骨作用增强。本研究虽然获取了ERS和骨发生两方面的差异表达基因数据，一方面其蛋白表达和功能活性尚需验证，另一方面仍需寻找能将两者相互联系、相互调控的关键靶点基因或信号通路，以便更好地了解成骨细胞ERS时的生理和（或）病理意义，对阐明骨科相关疾病（如成骨不全症、氟骨症）具有重要的理论意义。

作者：张亚楼 廖礼彬 冯树梅 李甜 郝子怡 张之璐 潘娟 陈亚茹 钟近洁 单位：新疆医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室