大鼠EAAT3真核表达载体构建及在Hella细胞中表达范文

作者：赵领洲，张玉梅，魏艳萍，李健学

作者：晁晓东,费舟,张磊,李娟,仝武军

【摘要】目的：克隆大鼠谷氨酸转运蛋白3（EAAT3）的cDNA，构建其真核表达载体并转染Hella细胞.方法：从大鼠的脑组织中提取RNA,采用RTPCR技术扩增EAAT3的基因编码区序列,将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).经酶切及测序鉴定后用阳离子脂质体将其转染到Hella细胞中，通过免疫印迹法鉴定其表达.结果:经双酶切、测序鉴定证实EAAT3基因的真核表达载体构建成功.免疫印迹法证实EAAT3基因的表达.结论:成功克隆了EAAT3编码区序列,并构建了其真核表达载体,为以EAAT3为基础的中枢神经系统疾病的治疗奠定了基础.

【关键词】载体蛋白质类;谷氨酸;真核表达载体

0引言

通常认为，细胞外液中没有使谷氨酸（Glu）失活的水解酶系统.对从神经末梢释放出来的Glu的清除和失活的唯一途径是通过位于突触前膜和神经胶质细胞膜上的兴奋性氨基酸转运体(EAAT)的摄取而实现［1］.目前，已克隆了5种EAAT［2］，分别是EAAT1，EAAT2，EAAT3，EAAT4和EAAT5.EAAT3主要分布在中枢神经系统海马结构的CA1CA4区的锥体细胞层、齿状回、小脑的颗粒细胞层及大脑皮质的ⅡⅣ［3］.最近研究证明EAAT3与主要的神经系统疾病，如肌萎缩性侧束硬化症、阿尔兹海默病、帕金森病、癫痫、脑缺血、外伤性脑损伤和精神分裂症等有关，但具体机制尚不清楚.我们通过对大鼠EAAT3基因进行扩增、克隆及序列分析,为研究和防治由于EAAT3功能紊乱而导致的中枢神经系统疾病奠定基础.

1材料和方法

1.1材料成年雄性SD大鼠1只，体质量350g，由第四军医大学实验动物中心提供；真核表达载体pcDNA3.1(+)（Invitrogen公司）；感受态大肠杆菌TOP10，pGEMTeasy试剂盒（Promega公司）；Trizol及lipofection2000（Invitrogen公司）；QuantscriptRTKitcDNA第一链合成试剂盒、TaqPlusDNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒及DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）；限制性内切酶XhoⅠ，EcoRI及T4DNA连接酶（TaKaRa公司）；EAAT3抗体（美国Santacruz公司）；其它试剂为进口或国产分析纯试剂.

1.2方法

1.2.1脑组织RNA的提取用10g/L戊巴比妥钠按20mg/kg静脉麻醉大鼠，断头取全脑，-70℃保存.取-70℃冻存的脑组织100mg，加入预冷至4℃的TrizolReagent1mL裂解细胞，用2mL匀浆器匀浆，静置10min后将裂解产物转移至微量离心管中，加1mL氯仿，振荡15s，室温静置2～3min，4℃，12000g离心15min.取上清液移入新的微量离心管，加异丙醇2.5mL，轻轻混匀，室温静置5～10min，4℃，12000g离心10min.弃上清，加入750mL/L乙醇1mL，洗涤沉淀物，4℃，7500g离心5min.弃上清，将沉淀物在真空中干燥5～10min.用DEPC水15μL溶解沉淀，-70℃保存.取待测样品2μL，紫外分光光度计比色法定量分析RNA含量.RNA实验过程中，所有实验用品均经DEPC处理，灭活RNA酶.

1.2.2引物设计根据GenBank中已报道的大鼠EAAT3cDNA(X94255)的基因序列设计合成大鼠EAAT3引物,上游引物:5′GAATTCGCCACCATGGGGAAGCCCACGAGCT3′,设有EcoRI酶切位点，下游引物5′CTCGAGCTAGAACTGCGAGGTCTGAGTGAAC3′设有XhoⅠ酶切位点.

1.2.3RTPCR扩增大鼠EAAT3cDNA根据TIANGEN公司试剂盒说明，用随机引物反转录获得EAAT3cDNA后进行PCR扩增.反应条件为预变性94℃5min,94℃30s，61℃30s，72℃90s，30个循环，72℃延伸10min.将PCR产物5μL在含溴化乙锭的10mL/L琼脂糖凝胶电泳,用ImageMaster9.VDS电泳成像装置观察结果并拍照.

1.2.4目的基因克隆和酶切鉴定将PCR回收产物与pGEMT载体于16℃连接过夜，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在铺有IPTG及XβGal的氨苄青霉素琼脂糖平板上进行蓝白菌落筛选,挑取白色阳性菌落,37℃过夜培养菌体.取菌液,提取质粒DNA,用EcoRI,XhoⅠ双酶切.观察EAAT3片段是否已克隆到pGEMT载体中.

1.2.5DNA序列测定挑选酶切鉴定正确的重组菌pGEMT/EAAT3,以重组质粒DNA为测序模板,由上海捷瑞生物技术公司测序.并用Sequence3.0分析软件对测序结果与GenBank中的数据进行分析.

1.2.6大鼠EAAT2真核表达载体的构建将带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的pGEMT/EAAT3双酶切,纯化回收酶切片段,同样对pcDNA3.1(+)载体进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切纯化回收,完全酶切后将pcDNA3.1(+)载体和EAAT3片段用T4DNA连接酶连接过夜,构建大鼠EAAT3真核表达载体pcDNA3.1(+)/EAAT3,将连接物转化大肠杆菌TOP10,用Amp抗性筛选阳性克隆，提取质粒DNA.用EcoRI,XhoⅠ双酶切、PCR方法鉴定所筛选的阳性克隆.将所克隆片段的序列在NCBI/GenBank数据库进行Blast比对和分析.

1.2.7转染Hella细胞将Hella细胞常规培养于含100mL/L小牛血清的DMEM中，于转染前1日收集细胞并接种于铺有盖玻片的六孔板中，细胞密度为6×105/孔.于37℃，50mL/LCO2培养24h，使每孔中细胞汇合达80%左右.按PolyfectTrans

fectionReagent说明书进行转染，重组质粒各设3个复孔，每孔操作如下：将重组质粒1μg溶于100μL不含血清及抗生素的DMEM培养基中，加入20μLPolyfect，旋涡混匀.20℃～25℃静置5～10min后，加入0.6mL含血清及抗生素DMEM培养基.吸出六孔板孔中的培养液，加入1.5mL含血清及抗生素新鲜DMEM培养基，迅速加入转染复合物，轻轻摇匀，37℃，50mL/LCO2培养48h后检测目的基因的表达.转染同时另设空载体转染对照和空白对照.

1.2.8免疫印迹法鉴定瞬时表达SDSPAGE后，用半干转移仪将蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素滤膜(NC膜)上，用10mL50g/L的脱脂奶粉封闭.一抗为1∶100兔抗鼠EAAT3多克隆抗血清,二抗为1∶5000用过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG.用增强化学发光蛋白免疫印迹法进行WesternBlot显色分析.

2结果

2.1PCR产物的克隆及酶切鉴定

2.1.1RTPCR结果通过RTPCR得到一条大小1571bp的单一特异性条带，与预期的EAAT3片段大小相符（图1）.

1:DNAMarkerⅣ;2:EAAT3PCR产物.

图1PCR产物的琼脂糖电泳分析

2.1.2pGEMT/EAAT3重组质粒PCR及酶切鉴定对pGEMT/EAAT3经EcoRI,XhoⅠ双酶切后,琼脂糖电泳后显现大小约1571bp的基因片段（图2）.

1:DNAMarkerⅣ;2:pGEMT/EAAT3双酶切.

图2重组pGEMT/EAAT3质粒的EcoRI和XhoⅠ双酶切鉴定

2.1.3pcDNA3.1(+)/EAAT3真核表达重组质粒PCR及酶切鉴定挑选阳性克隆，扩增并提取DNA.经EcoRI,XhoⅠ双酶切鉴定，琼脂糖电泳后显现大小约1571bp的基因片段（图3）.阳性克隆进一步进行PCR鉴定，经琼脂糖电泳后出现目的基因片段，表明插入片段的存在.

1:DNAMarkerⅣ;2:pcDNA3.1EAAT3双酶切.

图3重组pcDNA3.1(+)/EAAT3质粒的EcoRI和XhoⅠ双酶切鉴定

2.2阳性重组质粒的提取及质粒测序将初筛的2个阳性重组菌通过摇菌、质粒提取并纯化,进行DNA测序,将测序结果与GenBank中大鼠EAAT3基因(X94255)的标准序列完全一致.

2.3WesternBlot鉴定转染结果在转染pcDNA3.1(+)/EAAT3的Hella细胞表达的重组蛋白可以被抗EAAT3抗体所特异性识别，其大小与预期相同，同时空载体组与空白对照组无条带，表明EAAT3在Hella细胞中得到表达(图4).

3讨论

Glu是哺乳动物中枢神经系统内重要的兴奋性神经递质,可激活离子型受体和代谢型受体，参与神经元信号转导及病理等生命过程［4］.释放至突触间隙的Glu主要由位于神经元和神经胶质细胞膜上的高亲和力Glu转运体重摄取而失活［5］,因此,EAAT对保持突触间隙内Glu浓度在正常水平起重要作用，其主要功能是使Glu从突触间隙和细胞外液被迅速转运.它以跨细胞膜的Na+,K+和H+浓度梯度作为驱动力，转运2个Na+和1个K+携带1个负电荷的Glu进入细胞内，同时有1个K+和可能加上1个OH-/HCO3-从细胞内转移到细胞外作为交换，并至少有一个阳离子产生静电效应，因此Glu转运伴随有电流产生.正常生理条件下，EAAT将Glu摄入到神经元和胶质细胞，这种摄入依赖正常的电位差，尤其是细胞内外的钠离子梯度，使Glu在细胞内外的浓度差在1×103倍以上.

然而在很多病理情况下，EAAT抑制通过抑制反向转运而减少Glu的释放.帕金森病与EAAT3有很密切地相关性［6］；EAAT3表达水平在颞叶癫痫患者的病变组织中显著升高［7］；在大鼠中枢神经系统损伤的研究中发现中枢神经系统的损伤与EAAT的下降明显有关,但是在全脑缺血时EAAT3表达升高［8］；次声损伤后，EAAT明显下降［9］.Glu的浓度和位置的改变对神经系统的功能有着重要的意义，而它的摄取是其清除的主要途径，尽管现在研究已经表明EAAT3的功能与蛋白激酶C等密切相关［10］，但具体机制尚不清楚.因此，我们的EAAT真核表达载体的构建为进一步了解和治疗以其为诱因而导致的中枢神经系统疾病奠定了基础.

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