间充质干细胞定向范文

1材料和方法

1.1材料

SD大鼠（清洁级，四川大学华西医学中心实验动物中心提供，雌性，约150g）；胎牛血清（FCS，Gibco公司），胰蛋白酶（Gibco公司），血管内皮细胞生长因子（VEGF，invitrogen公司），碱性成纤维生长因子（bFGF,R&D公司）；FITC标记CD44、CD90、CD31、CD45抗大鼠单抗，Ⅷ因子山羊抗大鼠单抗（SantaCruz公司），即用型SP免疫组织化学检测试剂盒（SP-9003，北京中杉金桥生物公司）。

1.2大鼠MSCs的培养

本研究采用梯度离心法加贴壁筛选法。取SD大鼠，颈椎脱臼法处死，无菌条件下分离股、胫骨，暴露骨髓腔。用低糖无血清DMEM培养液冲出骨髓，离心后弃上清液，以无菌PBS液稀释。取离心管，分别加入等量Percoll分离液（ρ=1.073kg/L）和骨髓稀释液，离心30min（3000r/min）,仔细吸取白色单核细胞层，洗涤后用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L链霉素的低糖DMEM培养基（pH=7.2～7.4）重悬，并调整细胞浓度至4×105/ml，接种于250ml培养瓶，放入37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱静置培养。7d后全量换液，后每3d换液1次。至14～16d时，将融合生长约80%的细胞以0.25%胰酶-0.04%EDTA消化，按1∶3传代，定期取生长状态细胞进行倒置相差显微镜观察。

1.3大鼠MSCs表面抗原检测

取生长已达到90％以上融合的P3代细胞，用0.25%胰酶-0.04%EDTA消化后，离心去上清液，无菌PBS液洗涤，4℃下4%多聚甲醛固定15min后，再用PBS冲洗。分别加入1∶100稀释FITC标记的CD44、CD90、CD31、CD45单抗，于37℃下避光孵育30min，DAPI复染细胞核，90%丙三醇封片，使用激光共聚焦显微镜观察。

1.4试验分组及诱导分化

将P3代大鼠MSCs消化后按2.5×105/ml密度分为两组，即诱导组及对照组。诱导组换入含10%FCS、10μg/LVEGF、4μg/LbFGF的低糖DMEM培养基进行内皮方向诱导分化；对照组换入新的含10%FCS低糖DMEM培养基。两组均放入37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱静置培养，每2d换液1次。

1.5内皮细胞特性的鉴定

两组均继续培养14d后，取出细胞，相差显微镜观察细胞形态变化，使用倒置荧光显微镜进行CD31免疫荧光检测，并计算其CD31阳性表达率。

2结果

2.1大鼠MSCs细胞形态学及表面抗原检测

原代培养MSCs3d后可见细胞贴壁，5d后出现细胞集落，细胞大小均一，呈长梭形或多角型；10d后细胞基本达到90%以上融合，紧密排列成栅栏状，栅栏中心呈多层分布。MSCs细胞CD44、CD90免疫荧光染色阳性（图1）；CD31、CD45均为阴性（未显示）。

2.2诱导分化后细胞形态学变化及相关抗原检测

诱导组细胞内皮方向诱导14d后，见细胞逐渐变大，形态由长梭形、多角形变为扁平多角形，并呈铺路石样排列（图2a）,具有典型内皮细胞形态。诱导组细胞CD31免疫荧光染色均为阳性（图2b），其阳性表达率＞95%；而对照组细胞形态无明显变化，仍为大小一致的长梭形或多角形，且CD31免疫荧光染色为阴性（结果未显示）。

3讨论

在治疗严重缺血性血管疾病的过程中，治疗性血管生成是近年来研究的热点之一。血管生成的自然过程是多种细胞因子协调有序相互作用的复杂过程，而骨髓中干细胞能合成分泌多种促进血管生成的因子［4，5］。说明骨髓可成为在缺血条件下促进新生血管形成的有效材料。已有多项研究表明骨髓中存在的内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）可在一定环境下被诱导为成熟内皮细胞，并能增加缺血组织的新生毛细血管密度［6～10］。并且在临床实验中也取得良好效果［11］。这些都为缺血性疾病的治疗和血管组织工程种子细胞提供了新的途径。但目前国内外对于EPCs的分离鉴定尚无统一标准，且EPCs在体外扩增条件要求高，花费大，扩增数量有限，很难较好地满足当前缺血性疾病治疗和组织工程所需种子细胞的要求。故EPCs可能并不是最佳的选择。

骨髓间充质干细胞是一族具有自我复制和多向分化潜能的细胞,在一定条件下可分化成骨、软骨、脂肪和内皮细胞等中、内、外胚层细胞。具有易于获得、能大量扩增等特点，这使得MSCs成为种子细胞新的选择。本实验使用密度梯度离心法加贴壁培养法分离并纯化骨髓单核细胞，对其进行细胞形态学及表面抗原荧光检测，结果显示所得细胞呈长梭形，排列为栅栏状或螺旋状，且表达CD44、CD90，同时并不表达CD31、CD45，符合MSCs表现。经过内皮诱导培养14d后，细胞形态发生较大变化，由长梭形变为扁平多角形，细胞呈铺路石样排列，且所得细胞高度表达CD31，说明诱导后细胞获得了内皮细胞的特性，证明了MSCs在VEGF和bFGF诱导下可向内皮细胞方向分化。本研究使用密度梯度离心加贴壁筛选可获得MSCs，体外诱导可获得内皮细胞，该法取材方便,操作相对简单、安全，为MSCs移植治疗性血管新生提供实验依据。但本研究未涉及诱导后细胞生物学性质的研究，这有待在今后的研究中完善。