栀子苷对流感病毒的抑制作用范文

摘要

为探讨栀子苷对甲型H1N1病毒的抑制效应，进行了相关体内外实验研究。体外实验中采用MTT法判定栀子苷对MDCK细胞的毒性作用。以帕拉米韦为阳性对照药，根据MTT比色值，观察栀子苷对甲型H1N1流感病毒感染的MDCK细胞的细胞病变效应(cytopathiceffects，CPE)，计算不同给药方式(预防给药、直接灭活及治疗给药)及不同药物剂量干预下，栀子苷对甲型H1N1流感病毒的抑制效率;体内实验以甲型H1N1流感病毒感染ICR小鼠，建立甲型H1N1流感病毒小鼠肺炎模型，比较栀子苷不同剂量干预下，小鼠肺指数、肺组织病理学检查及小鼠存活率。实验结果显示，栀子苷的细胞毒性小，其TD50大于1040μmol/L;栀子苷在预防、直接灭活及治疗给药方式下，对甲型H1N1流感病毒感染的MDCK细胞抗病毒EC50分别为91.90、96.25和87.68μmol/L，对CPE有明显抑制作用;栀子苷可显著降低甲型H1N1流感病毒感染小鼠的肺指数、减轻肺组织炎症损伤、降低小鼠死亡率、延长生存时间。实验结果表明，栀子苷在体外能有效抑制甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞的CPE，在体内能有效保护甲型H1N1流感病毒对小鼠肺部的攻击作用，可能为流感病毒的防治提供一个新的选择。

关键词

栀子苷;甲型H1N1流感病毒;细胞病变效应;抑制作用

2009年初，甲型H1N1流感病毒在北美地区爆发，随后迅速蔓延至多个国家和地区［1］。近年来，小规模区域性H1N1流感流行病例仍有出现，该毒株已成为人际间传播的主要流行性毒株之一。目前临床上用于治疗流感病毒感染的药物主要有离子通道M2阻滞药(金刚烷胺、金刚乙胺)和神经氨酸酶抑制药(扎那米韦、奥司他韦及帕拉米韦)。但由于流感病毒的自身易于变异的特点及其抗病毒药物广泛使用，耐药毒株不断出现，使之成为目前全球难以治疗的病原［2－3］，因此，寻找并开发安全有效的抗流感药物已迫在眉睫。我国中草药自然资源丰富，品种繁多，从中寻找高效、低毒、广谱的抗病毒成分，开发出能够应用于临床防治流感的新型药物很有意义。栀子苷(geniposide)系栀子提取物，为环烯醚萜苷类化合物，相关研究证实，其具有抗炎、抗氧化等生物活性功能［4－9］。为探讨栀子苷对甲型H1N1病毒的抑制效应，进行了相关体内外实验研究，旨在为其临床防治流感病毒应用提供实验依据。

1材料

1.1细胞及病毒株马丁达比犬肾上皮(Madin-Darbycaninekidney，MDCK)细胞，江苏省疾病预防中心省级流感病毒参比实验室保存株，传代后使用。甲型H1N1流感病毒A/Jiangsu/1/2009(NT0901)，系江苏省疾病预防中心省级流感病毒参比实验室保存病毒株，复苏后由流感病毒的MDCK细胞分离法分离培养，测得血凝效价为28。

1.2药品和试剂栀子苷标准品(C17H24O10，Mr388.36，批号110749)购自中国食品药品检定研究院，纯度≥97.5%。阳性对照药物为帕拉米韦(C15H28N4O4，Mr328.41，批号H20130029)购自广州南新制药有限公司，体外试验前用高纯水配制成0.6μmol/L的母液，过滤除菌后备用。D-MEM培养液(含有L-谷氨酰胺)、0.25%Trypsin-EDTA胰酶、TPCK-胰酶、7.5%牛血清白蛋白组分V、青、链霉素母液、胎牛血清(FBS)、HEPES缓冲液、PBS液、DPBS液(美国Gibco公司);四甲基噻唑蓝(MTT，上海怡成公司);二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)。细胞培养液为含有10%胎牛血清的DMEM溶液，细胞维持液则为不含血清，含有1%TPCK-胰酶的DMEM溶液。

1.3动物4～5周龄SPF级ICR雌鼠，体重为15±1g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号:SCXK(沪)2013-2016。

1.4仪器CO2培养箱(日本Yamato株式会社);倒置显微镜(日本Olympus公司)。

2方法

2.1病毒组织细胞半数感染量(TCID50)滴定用病毒培养液将病毒进行1∶10稀释成1×10－1、1×10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5、1×10－6、1×10－7、1×10－8、1×10－9、1×10－10共10个稀释梯度。以每孔3×104接种MDCK细胞于96孔细胞板中，37℃、5%CO2孵育24h，至细胞长成单层后，弃细胞培养液，接种每孔100μL稀释病毒液，每稀释度设4孔，并设正常细胞对照组。每日观察细胞形态，记录细胞病变程度。判定细胞病变效应(cytopathogeniceffect，CPE)指标:“0”表示无明显病变，“1”表示CPE为l%～25%，“2”表示CPE为26%～50%，“3”表示CPE为51%～75%，“4”表示CPE为76%～100%，每孔随机选择10个视野，将各个视野的CPE进行累计后计算均值，判定该孔的CPE。依据《国家流感中心标准操作规程》［10］，72h后检测病毒的红细胞凝集滴度(HA，hemagglutination)，采用Reed-Muench法［11］计算出病毒的TCID50。

2.2药物毒性测定将不同配比剂量的栀子苷分别加入细胞已长成单层的96孔培养板中，每孔0.1mL，每个剂量设4个复孔，设正常细胞对照4孔，置于37℃、5%CO2温箱内培养72h后用倒置显微镜观察细胞形态变化(CPE法)，同时弃培养液上清液，每孔加入新鲜配制的含5mg/mL的MTT溶液50μL，继续培养2～3h后，弃MTT上清液，以PBS液洗3次，每孔加DMSO150μL，轻摇5～10min，待紫色结晶完全溶解，以空白调零，自动酶标仪在570nm波长处测出细胞对照组和各实验组的吸收度。以对照孔为参照，计算各实验孔细胞的活力比值。

2.3MTT法测定CPE根据预试验确定药物浓度，栀子苷为260、130、65、32.5μmol/L，阳性药帕拉米韦为0.3μmol/L。每个药物浓度及正常细胞对照和病毒对照均设4孔细胞。病毒攻击量为100TCID50。栀子苷干预分3组进行:预防给药组，以含药培养液预先与细胞孵育24h，再以NT0901感染细胞;细胞外直接灭活组，药液与病毒液混合，置4℃作用24h后，加入细胞层;治疗给药组，以NT0901作用细胞2h后给予药物，连续观察3d，记录各孔CPE。病毒对照组细胞病变达“4”，且细胞对照组无病变时，确定为MTT比色的最适时间点，进行比色，调节酶标仪吸收波长为570nm，读取数据，计算病毒抑制率实验重复3次。

2.4对小鼠流感病毒性肺炎的保护效应60只小鼠随机分成6组，每组10只。栀子苷试验设3个剂量组，分别为5、10及20mg/kg，另设帕拉米韦对照组(剂量:30mg/kg)、病毒感染对照及正常对照组;栀子苷及帕拉米韦给药方式为腹腔注射。小鼠予以3%水合氯醛麻醉后，除正常对照组予以无菌生理盐水50μL滴鼻外，各组均予病毒液50μL滴鼻。感染后24h后药物干预，连续给药至第6天，称重后处死小鼠，摘取全肺解剖称重，计算肺指数［肺指数=(肺重/体重)×100%］;小鼠肺组织甲醛固定24h后，常规制成5μm石蜡切片，HE染色，观察小鼠肺组织病理改变。为比较病毒攻击后小鼠的存活情况，连续观察12d，记录小鼠体重变化及病死数。

2.5统计学方法采用SPSS18.0和GraphPadPrism6统计软件处理，计量数据以x珋±s表示，组间比较用t检验，多组资料比较采用ANOVA检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3结果

3.1病毒组织细胞半数感染量(TCID50)依照国家流感中心标准操作规程［10］，根据红细胞凝集试验结果，以Reed-Muench法计算出流感病毒株NT0901的TCID50为10－4.5。

3.2栀子苷对MDCK细胞的毒性作用不同配比剂量栀子苷与MDCK细胞共培养72h后，MTT法对各实验孔细胞活力进行测定并以对照孔为参照，计算各实验孔细胞的活力比值。实验显示，在32.5～1040μmol/L浓度范围各剂量栀子苷作用72h对MDCK细胞体外生长没有明显抑制作用(P＞0.05，图1)。据此可以确认栀子苷对MDCK细胞的半数中毒浓度(TD50)大于1040μmol/L。根据此结果并结合相关文献［11－12］，本实验在研究栀子苷对流感病毒抑制作用时，确定栀子苷和帕拉米韦的母液浓度分别为260和0.3μmol/L。

3.3栀子苷对CPE保护作用的形态学观察病毒感染72h后，镜下可见病毒对照组细胞肿胀变圆、萎缩、聚集、破碎融解等CPE现象;正常对照组细胞均贴壁生长，边缘清晰、界限清楚、生长状态良好;栀子苷预防、直接灭活及治疗给药3组细胞形态未见发生明显变化;帕拉米韦组细胞亦未见明显变化。病毒对照组、正常对照细胞组、栀子苷不同给药方式组及帕拉米韦组的镜下形态观察见图2(栀子苷和帕拉米韦各组皆为母液)。

3.4MTT法测定栀子苷对CPE保护作用感染72h后，依Reed-Muench法计算出栀子苷预防给药、药毒混合及治疗给药组的EC50分别为91.90、96.25和87.68μmol/L，帕拉米韦EC50为0.122μmol/L，各组数据详见表1。根据MTT读取的吸收度，计算出不同给药方式、不同给药浓度下栀子苷对NT0901的病毒抑制率。结果显示，预防给药、直接灭活及治疗3种给药方式下，栀子苷对NT0901致CPE保护作用随药物剂量的增加而增强，结果见图3。

3.5栀子苷对NT0901感染小鼠后肺指数及存活率的影响在栀子苷及帕拉米韦干预小鼠NT0901肺炎第6天，各组的肺指数值结果显示:栀子苷5、10、20mg/kg剂量组小鼠的肺指数值均显著低于病毒组(P＜0.05)，但栀子苷3个剂量组间未见显著差异，见图4。小鼠肺组织病理学检查结果显示(图5):病毒对照组小鼠肺脏出现典型间质性肺炎，支气管、细支气管壁及其周围组织和小叶间隔等肺间质充血水肿，正常肺组织结构消失，部分气管腔内可见渗出液及坏死组织，大量淋巴细胞、单核细胞在细支气管壁及其周围浸润;栀子苷5mg/kg治疗组炎症反应程度略轻于病毒对照组;栀子苷10、20mg/kg治疗组与病毒对照组比较，其炎症病理表现有明显减轻，与帕拉米韦组比较炎性损伤程度大体相近。小鼠感染NT0901后，其活跃度逐渐降低，表现为抱团聚集、竖毛、反应力下降等，病毒对照组于第4天开始出现死亡，至12d时小鼠存活率仅40%;栀子苷5mg/kg组小鼠于第5天开始出现死亡，至12d时存活率为60%;栀子苷10、20mg/kg组小鼠分别于第7天及第6天开始出现死亡，至12d时存活率分别为80%和70%，与阳性对照药帕拉米韦组(存活率80%)基本接近。所有各干预组与病毒对照组比较皆有显著差异(P＜0.05)，见图6。

4讨论

茜草科栀子树的成熟果实栀子，药食两用，其性味苦寒，有清热泻火、清凉解毒的功效，长期以来应用于热病心烦、目赤肿痛、消化道出血及扭挫伤等的治疗［13］，甚至对神经系统及心血管系统疾病亦有较好的治疗作用［14－18］。本研究在体外实验中将给药方式分为3组，治疗给药方式是模拟人体感染流感病毒后，用药物进行治疗的过程;预防给药方式则是模拟人体感染流感病毒前，用药物进行预防的过程;药毒混合作用组，则是试图观察栀子苷是否有直接灭活病毒的作用。药物的跨膜转运是药物进入体内过程的前提，也是其发挥活性所必需，贯穿药物在体内作用的整个过程。本研究结果显示，3种给药方式抑制甲型H1N1流感病毒的CPE作用都随着药物剂量的增加而增强，图3表明同一剂量组下尽管给药方式不同，但对甲型H1N1流感病毒导致的MDCK细胞病变均有较好的保护作用，3种给药方式对病毒的抑制作用并无明显差异。根据实验结果可以初步推测:预防给药时，可能是栀子苷与MDCK细胞表面相关膜结构结合，从而影响H1N1流感病毒与细胞的受体结合，国内曾有研究［19］发现栀子苷可通过改善细胞膜流动性，维持细胞膜的正常功能来发挥抗流感病毒感染的作用，本结果与此研究结论有一定吻合;治疗给药时栀子苷对CPE抑制作用，可能与栀子苷一定程度上抑制病毒核酸复制或复制后转录有关，韩静文等［20］研究认为栀子苷在MDCK细胞模型上表现为被动扩散，且不受P-糖蛋白的影响，还可能存在细胞旁路转运;直接灭活给药时，则有可能是栀子苷与H1N1流感病毒某些特定部位结合有关。尽管本研究结果提示3种方式皆有抑制CPE效应，但其具体相关机制有待深入探究。

甲型流感病毒感染气道上皮细胞后，单核-巨噬细胞被首先募集到感染附近激活，继而启动一系列炎性反应，释放前炎症因子及炎性介质，包括IL-1、6、8及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，而这些细胞因子能进一步激活损伤内皮细胞、粒细胞及血小板等，释放氧自由基、溶酶体酶等介质，这些炎性介质相互促进，形成逐级放大的“瀑布样效应”，结果导致广泛的病理损伤，在肺部则表现为广泛的炎性渗出及肺水肿［21］。肺指数是反映肺炎性渗出及实变程度的重要指标，本研究观察到栀子苷治疗组肺指数明显低于模型组，与阳性药帕拉米韦组相近。本研究结果表明，栀子苷能够减少小鼠H1N1流感肺炎模型的死亡率，提示栀子苷对H1N1流感肺炎小鼠有显著的保护效应，推测栀子苷可能在体内直接发挥了抗病毒作用，或是在保护小鼠病毒性肺炎的肺水肿及炎性因子“瀑布反应”方面发挥了相应作用。

总之，栀子苷在体外能有效抑制甲型H1N1流感病毒的CPE，在体内则能有效保护甲型H1N1流感病毒对小鼠肺部的攻击作用，初步表明其可能为流感病毒的防治提供一个新的选择，但其具体机制尚待进一步探讨。

作者：张耘实 祁贤 卢协勤 刘星 冯旰珠 单位：南京医科大学第二临床医学院 江苏省疾病预防控制中心 南京医科大学第二附属医院药剂科 南京医科大学第二附属医院呼吸科