毒物学安全性评论方式范文

作者：宋雁李宁单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所北京

免疫毒理学是毒理学的一个重要分支，是研究外源性化学物、物理因素及生物因素对机体免疫系统不良反应及其机制的一门学科。在某些情况下，免疫系统是容易受到攻击的靶器官，在其他器官系统尚未观察到毒作用时，免疫系统可能已经受到损害，如免疫病理学改变、细胞免疫异常、体液免疫异常、特异性免疫改变或宿主抵抗力下降等。因此，免疫系统的效应变化是某些危害的毒理学安全性评价中较为敏感的指标，而选择敏感的生物标志物检测早期健康危害效应将会极大的提高安全性评价工作的科学性和效率。例如，美国有毒物质和疾病登记局(agencyfortoxicsubstanceanddiseaseregistry，ATSDR)在制订砷、狄氏剂、镍、1，2-二氯乙烷、2，4-二氯酚的安全限量时，就采用了免疫毒理学的安全性评价结果。20世纪80年代初，许多国家的相关部门相继尝试制定免疫毒性的评价策略。其中有关杀虫剂和药物的免疫毒性评价方案最早出台。欧洲(欧盟、荷兰等)和美国(美国环境保护署EPA、美国国家毒理学规划NTP和美国食品药品管理局FDA等)都进行了早期的免疫毒性试验指南的制定。但由于免疫系统组成和功能的高度复杂性，以及免疫毒物毒作用的靶细胞和靶分子的多样性，目前尚未有一种免疫毒理学试验方法能够从整体、细胞和分子水平全面反映外源性化学物对整个免疫系统的影响，因此国际上一般采用一组试验多项指标来进行综合评价。而且分级筛选的试验方案也逐渐被多家国际机构所认可，成为免疫毒理学安全评价的精髓，目前各国将免疫毒理学安全评价方法的重点放在分级试验策略的优化和国际间的协调统一上。

1美国的免疫毒性评价程序

1.1美国FDA的免疫毒性评价指南

1982年美国FDA颁布了红皮书I，就免疫毒性评价而言，内容仅涉及在一般毒理学试验中进行血液学指标、血生化指标以及免疫器官脾的组织病理学检测。考虑到所要监管的产品可能具有免疫毒性，1993年FDA颁布的红皮书II《直接食品添加剂和着色剂的毒理学安全评价指南》中将免疫毒理学安全评价方法纳入其中。2007年修订的红皮书2000中免疫毒理学安全评价方法继续采用1993年版的内容。该指南适用于食品添加剂、药品、生物制品及医疗器械等的免疫毒理学安全性评价。在具体实施过程中，推荐采用个案处理原则。制定了标准试验，同时建议根据具体情况选择其他合适的试验或指标。试验分为两个水平:水平I，无需向动物注射抗原，可以采用标准的毒理学试验进行免疫指标的测定;水平II是免疫功能试验，通常需要多个系列组，每个系列组用来进行不同的试验。水平I包括基础指标和扩展指标，基础指标通过标准的动物短期和亚慢性毒性试验测得(主要的免疫毒性指标包括血液学指标:白细胞数及其分类;血生化指标:血清总蛋白，白/球蛋白比;组织病理学:淋巴器官如脾、胸腺、淋巴结、骨髓等)，以及啮齿类动物发育毒性试验(包括:a.母体发病率和死亡率;b.组织病理学:胎体的肝脏、胸腺和脾脏;c.F1和F2代的血液学指标、血生化指标、组织病理学、器官重量和体重等);扩展指标:血液学指标中外周血或脾脏B淋巴细胞数、T淋巴细胞数和T淋巴细胞亚群分析;血生化指标如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、补体、血清细胞因子如IL-1、IL-2和γ-干扰素、血清自身抗体水平等;组织病理学:动物脾脏以及淋巴结B淋巴细胞和T淋巴细胞的免疫组化，脾脏生发中心和动脉周围淋巴鞘的精密测定，淋巴结中淋巴滤泡和生发中心的精密测定，胸腺皮质和髓质的形态学测定。体外免疫细胞的功能测定:NK细胞活性测定;B淋巴细胞和T淋巴细胞增殖试验;巨噬细胞功能试验;骨髓干细胞测定。水平II也包括基础指标和扩展指标，基础指标包括T细胞依赖性体液免疫应答、T细胞非依赖性体液免疫应答、迟发型变态反应等，扩展指标包括宿主抵抗力(PYB6肿瘤细胞、细菌、病毒、真菌和寄生虫等)。

1999年美国FDA的医疗器械和放射健康中心(CenterforDevicesandRadiologicalHealth，CDRH)颁布了免疫毒理学试验指南，这一指南用于指导医疗器械及组成成分的免疫毒理学评价，提出最佳的试验方案。包括一个流程图和三个表格。流程图用于决定是否进行免疫毒性试验(G95-1/ISO10993)，如果某种医疗器械与已合法上市的医疗器械的材料、与人体接触方式、剂量和接触时间一样，或其有长时间使用历史但无毒性结果，或文献报道其无毒性，则不需进行免疫毒性试验。如通过流程图建议进行免疫毒理学试验，则通过三个表格的指示来进一步选择所要进行的免疫毒性试验，对免疫抑制、慢性炎症、超敏反应、免疫刺激和自身免疫进行评价。表格1列出根据医疗器械的材质、类型、与人体接触途径和时间选择不同的免疫毒性试验;表格2包括关键指标和非关键指标，组织病理学是炎症和自身免疫的关键指标，而是免疫抑制、超敏反应和免疫刺激的非关键指标;体液免疫是免疫抑制、超敏反应、免疫刺激和自身免疫的关键指标，而是炎症的非关键指标;T淋巴细胞免疫分析均为关键指标;NK细胞活性和宿主抵抗力仅是免疫抑制的关键指标;表格3则列举了表格2中关键或非关键指标的具体方法。2002年美国FDA的药物评价与研究中心(CenterforDrugEvaluationandResearch，CDER)公布了审查新药的免疫毒理学评价行业指南。该指南较为全面和详细，涵盖了免疫毒性概念中的所有内容如免疫抑制、免疫原性、超敏反应、自身免疫和不良免疫刺激。免疫抑制筛选试验首先进行标准毒性试验，通过动物重复剂量试验测定血液学指标、血生化指标(血清白蛋白和白/球比)、组织病理学(脾、胸腺、淋巴结和骨髓)、免疫器官重量和脏体比以及动物感染和肿瘤发生率;扩展试验对免疫功能进行测定如对绵羊红细胞的初级免疫应答、对绵羊红细胞的次级免疫应答、NK细胞活性测定、细胞毒性T细胞杀伤试验、迟发型变态反应试验、宿主抵抗力试验、骨髓祖细胞功能试验、巨噬细胞功能测定、中性粒细胞功能测定、免疫细胞表型及标志物。免疫原性用于测定药物引起免疫反应的可能性，但采用非临床毒理学试验手段仍困难重重，因此CDER未推荐明确的方法。超敏反应分为I型-IV型，该指南主要针对小分子药物进行评价。

I型超敏反应的评价方法包括:主动皮肤过敏反应试验、被动皮肤过敏反应试验、主动全身过敏反应试验。但上述方法对于确定是否具有潜在的I型超敏反应仍十分有限，并未正式推荐使用。目前尚无标准的非临床试验可以很好预测II型和III型超敏反应，但CDER认为如果病理学检测结果显示可能异常即推荐按照“个案处理原则”进行深入研究。IV型超敏反应推荐的方法包括:Buehler封闭斑贴试验＞豚鼠最大值试验(GuineaPigMaximizationTest，GPMT)＞局部淋巴结试验。目前尚未制订标准的试验方法用于测定药物的自身免疫毒性和不良免疫刺激。该指南同时提供了一个流程图用于指导免疫毒理学评价方法的选择，主要考虑了药物的给予途径、免疫抑制方面的证据、针对人群、针对的疾病、药物代谢物是否在免疫系统有蓄积等因素。

1.2美国EPA的免疫毒性评价指南1982年，美国EPA最早出台了农药免疫毒性评价指引，要求对新农药按照两级筛选程序进行评价。但当时该指引所推荐的方法和动物模型没有被标准化和验证，是不成熟的。之后的十多年时间里多次对早期版本进行了修订，曾先后提出了OPPTS800.3550、880.3800和870.7800等指南用以指导免疫毒性评价。1996年美国EPA修订了免疫毒性试验指南OPPTS800.3550，该指南主要针对农药和有毒有害物质的免疫毒理学安全性评价。尽管超敏反应、免疫刺激和自身免疫也是免疫毒性的重要内容，但该指南仅限于免疫抑制。作为受试物免疫毒理学安全评价的I级筛选试验，包括标准毒性试验和免疫功能试验。标准毒性试验即进行动物重复剂量毒性试验，小鼠和大鼠是首选试验动物，可选择单一性别的动物，但必须保证该性别动物对受试物更为敏感，每组动物至少10只，连续给予受试物至少30天。试验设阴性对照组，阳性对照组，低、中、高3个受试物剂量组和1个卫星试验组。测定血液学指标(白细胞数及其分类、红细胞数、血小板数、血红蛋白、红细胞压积)，血生化指标(血糖、谷丙转氨酶、尿素氮、白蛋白、总蛋白等)，组织病理学(脾、胸腺、淋巴结、骨髓、肝、肺、肾、肾上腺、脑垂体、性腺)，免疫器官重量及其脏体比，脾、胸腺和骨髓细胞数和细胞存活率。免疫功能试验中体液免疫包括抗体空斑形成细胞试验、血清免疫球蛋白测定;细胞免疫包括混合淋巴细胞试验、迟发型变态反应、细胞毒性T细胞杀伤试验;非特异性免疫毒性试验包括NK细胞活性测定、巨噬细胞活性测定。如果以上试验出现一项阳性结果、结果无法解释、有资料显示该受试物具有免疫毒性或与其结构相关产品具有免疫毒性，均需进行II级筛选试验。

随后美国EPA公布了OPPTS880.3800，本指南为II级筛选试验，如果OPPTS800.3550I级筛选试验中细胞免疫或体液免疫出现异常则必须进行宿主抵抗力试验，另外可采用其他的试验如血清补体、抗体对T细胞非依赖抗原反应、T淋巴细胞和B淋巴细胞亚群分析、粒细胞功能测定、骨髓功能测定、细胞因子测定、空斑形成细胞反应、淋巴细胞对有丝分裂原的增殖反应、体内注射异源淋巴细胞后腘窝淋巴结增大反应、激素、免疫系统发育、巨噬细胞发育及其功能试验。

1998年美国EPA制订了OPPTS870.7800，该指南主要针对农药和有毒有害物质重复暴露的免疫抑制评价。并且引入限制试验的概念，即如果受试物经口摄入量至少1000mg/kg或经呼吸摄入量达到2mg/L仍未观察到毒性反应，则不需设计3个剂量，只需依据人体暴露量进行较高剂量的试验即可。小鼠和大鼠为首选试验动物，可选择单一性别的动物，但必须保证该性别动物对受试物更为敏感，每组动物至少8只，连续给予受试物至少28天。试验设阴性对照组、阳性对照组和低、中、高3个受试物剂量组。进行免疫功能试验如抗体空斑形成试验、免疫球蛋白(SRBC免疫动物后4天测定血清IgM)、NK细胞活性测定、血液或脾T淋巴细胞和B淋巴细胞亚群分析等。

1.3美国NPT的免疫毒性评价指南

1988年LUSTER等提出外源性化学物和药物小鼠免疫毒性评价方案，被美国多家毒理学机构及实验室采用。此方案分两级，第一级筛查可能的免疫毒性物质，包括七类十余项指标;第二级包括四类八项指标，对于第一级试验中的一个或多个试验有影响的化合物需进行进一步的试验研究。

1.4美国NRC推荐的人群免疫毒性检测方案

人群免疫毒性检测对于确定外源化学物对人体健康危险度评价有十分重要的意义。上世纪80年代由美国国家研究委员会(NationalResearchCouncil，NRC)提出的人群免疫毒性检测方案分为三级，所有接触免疫毒物的人均需进行一级检测，在一级检测中发现有异常的所有人或选择部分接触人群进行二级检测，如发现异常则需进行三级试验。

2欧洲的免疫毒性评价指南

1983年欧盟首次提出对新医疗产品进行免疫毒性评价的意义和必要性，虽存在很多的不足，其仅对免疫器官进行组织病理学检测，但引发了学术界和官方管理机构对新医疗产品的非临床免疫毒性评价的广泛关注。欧洲医药评价署(EuropeanAgencyforEvaluationofMedicalProduct，EMEA)的专卖医药委员会(CommitteeforProprietaryMedicinalProducts，CPMP)在1998年首次引入免疫毒性的新概念，即免疫毒性评价的重点不再局限于免疫抑制，明确强调药物诱导的自身免疫和超敏反应也是免疫毒性评价的重点内容。2000年CPMP了重复剂量毒性试验指南，其中第6部分对上述免疫毒性指导原则进行了更新，可适用于人用药物如生物技术衍生物、疫苗、抗癌药物等的毒性评价。一般选用两种哺乳动物进行试验，其中必须有一种为非啮齿动物。试验设阴性对照组、阳性对照组和受试物3个不同剂量组，试验周期为28天。初级筛选试验中进行血液学检测、免疫器官重量及其脏体比、免疫器官组织病理学检测、骨髓细胞数、淋巴细胞亚群分析和NK细胞活性测定。如任一结果呈阳性，则需进行体内或体外免疫功能扩展试验如迟发型变态反应、淋巴细胞对有丝分裂原刺激的增殖反应、巨噬细胞功能试验、对T细胞非依赖抗原的抗体反应以及宿主抵抗力试验。

EMEA更名为欧洲医药署(EuropeanMedicinesAgency，EMA)于2005年加入了“人用药物免疫毒性研究ICHS8”，并于2006年实施。

该指南用于对人用药物的非临床免疫抑制和免疫刺激的评价，而不包括自身免疫和超敏反应。值得一提的是，该指南并不适用于ICHS6所评价的生物技术衍生药物和其他生物制品。试验包括标准毒性试验和追加试验。2008年EMA下属的人用医药产品委员会(CommitteefortheMedicinalProductsforHumanUse，CHMP)的“基因治疗药物临床使用前的非临床研究指导原则”也指出，有些基因治疗药物可能携带可编码对免疫系统具有影响的生长因子、细胞因子或大分子的基因，要评价其免疫原性和免疫毒性需进行体液和细胞免疫功能试验。

3日本的免疫毒性评价指南

在欧洲医药署和美国FDA的指导原则出台之后，日本厚生劳动省(MHLW)于2004年了免疫毒性评价指南草案，基于这两家机构的指导原则，MHLW也采纳了分级筛选的评价策略。首先进行标准毒性试验，通过动物重复剂量试验测定动物体重及脏器重量(脾、胸腺、肾上腺)、组织病理学(脾、胸腺、淋巴结和骨髓)。如在常规免疫毒性试验或其他研究中发现毒性时，需要在开始I期临床试验前进行初级抗体反应试验并选择性进行NK细胞活性试验。如出现阳性结果时对免疫毒性进行深入研究，包括骨髓细胞计数，免疫细胞表型分析，血清免疫球蛋白，免疫组织化学，抗体水平，NK细胞活性，淋巴细胞增殖反应，细胞毒性T细胞杀伤试验，血清补体，细胞因子，巨噬细胞或中性粒细胞功能试验，迟发型变态反应，宿主抵抗力试验，关节腔淋巴结反应(lymphnodereactionofarticularcavity)，速发型超敏反应，自身抗体，尿蛋白。MHLW也提出超敏反应的检测方法包括GPMT、贴片试验(patchtest)和Buehler试验，可根据具体情况选择不同的试验组合:Draize试验、佐剂和斑贴试验(adjuvantandpatchtest)和Buehler试验;弗氏完全佐剂试验(Freund’scompleteadjuvanttest)、开放皮肤试验(opencutaneoustest)、最优化试验(optimisationtest)和裂口辅助试验(splitadjuvanttest)。

4国际组织的免疫毒性评价指南

4.1ICH的免疫毒性评价指南

1997年国际协调委员会(InternationalConferenceofHarmonisation，ICH)制订了人用药物登记技术要求的生物技术衍生药物的临床前安全性评价指南S6［18］，其中涉及免疫毒性效应的有免疫抑制、免疫原性、自身免疫。考虑到药物对人体产生免疫原性的可能性，应进行抗体反应试验、抗体水平测定、补体活性试验、免疫器官的组织病理学检测。常规毒性试验不足以对生物技术衍生药物的免疫毒性进行评价，还应涵盖体液免疫、细胞免疫等方面的内容。但这一指南并未系统提出免疫毒性评价的具体方法。2005年9月15日，ICH了专门针对免疫毒性评价的ICHS8指导原则即“人用药物免疫毒性研究”，对于国际免疫毒理学来说是一个极具里程碑的事件。ICHS8将欧洲医药署(EMEA)、美国FDA药品评价和研究中心(CDER)以及日本厚生劳动省(MHLW)三方关于免疫毒性评价的观点中一致的方面统一起来，即关于免疫抑制和免疫刺激的评价。该指南主要用于人用药物的免疫抑制或免疫刺激评价，但不适用于ICHS6中涉及的生物技术衍生药物和其他生物制品的评价。初始筛选试验包括对啮齿类动物的标准毒性研究和非啮齿类动物的慢性毒性重复试验，试验方法涉及血液学(白细胞数及其分类)、血生化(球蛋白和白/球比)、免疫器官重量和组织病理学、血浆免疫球蛋白、感染和肿瘤发生率。然后对初始筛选试验结果、药物药理学特性、潜在目的人群、与已知免疫毒性物质的结构相似性、药物在人体的分布以及临床信息等因素进行权重分析，决定是否进行追加试验。追加试验包括T细胞依赖性抗体反应(TDAR)、免疫细胞表型分析、NK细胞功能、宿主抵抗试验、巨噬细胞和中性粒细胞功能试验以及迟发型变态反应(DTH)等。新的ICHS8指导方针指出如果恰当的评价标准试验终点，可以检测到大多数药物的潜在免疫抑制作用。ICH三方关于免疫毒性指导原则的进度和方式各有不同。对于是否在常规的标准毒理学试验中加入免疫功能性试验存在争议，只有EMEA要求常规筛选试验中应包括淋巴细胞亚群分析和NK细胞活性的测定。2010年初ICH又了ICHM3，即“药物在人体临床试验和上市授权前的非临床试验指引”，该指引在欧洲、美国和日本之间达到共识，并且希望能对药物的非临床试验方法达成国际间协调，尽量减少各国和地区间的分歧。对免疫毒性评价仍采用个案处理的原则，并依据ICHS8指导原则进行。

4.2OECD的免疫毒性评价指南

目前为止，经济发展和合作组织(OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment，OECD)尚未单独制订免疫毒理学安全评价指南，但在后期修订的一些非啮齿类或啮齿类动物28天经口毒性试验、啮齿类和非啮齿类90天经口毒性试验、慢性毒性试验和致癌试验等指南中阐明应观察免疫系统的毒性反应。对免疫器官脾、胸腺和淋巴结要进行组织病理学检测，这是免疫毒理学安全评价的一大进步，但遗憾的是缺乏必要的免疫功能检测，而后者在预测免疫毒性方面更为敏感。

4.3WHO的免疫毒性评价指南

WHO也对人群免疫毒性检测提出建议，WHO推荐的方案包括7个方面:血液学检查、体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫、淋巴细胞的表面标记、自身抗体、临床化学检查等。5我国的免疫毒性研究技术要求的现状我国免疫毒理学的研究起步较晚，从70年代末以来有一些关于环境污染物、药物、农药和工业毒物等免疫毒性方面的报道。目前我国对外源性化合物的安全性评价中涉及免疫毒性评价的只有化学品毒性鉴定管理规范和中药、天然药物免疫毒性研究的技术指导原则，后者仅针对过敏性和光过敏反应;食品中仅保健食品检验与评价技术规范-2003年版中涉及保健食品增强免疫功能的评价方法;农药登记材料要求仅包含了致敏性试验。食品、农药、有机物等物质毒理学安全性中均无免疫毒性的评价，这与国际趋势和实际需要远不相符，无法与其他国家或相关国际组织进行有效的验证和比对，这不仅加大了我国在安全性评价方面的潜在风险，而且在一定程度上限制了我国在危险性评估方面的发展。随着我国食品工业技术的发展和新资源食品开发力度的加快，不乏有一些外源性物质可能是以免疫系统作为靶器官，因此建立快速、灵敏的免疫毒理学安全评价的检测方法迫在眉睫。6结语随着现代毒理学研究技术和方法的发展，国际上的毒理学安全性评价理论和评价方法也不断被完善，除传统毒性试验外，细胞毒理学、分子毒理学方法进入安全性评价体系中，根据受试物的特点选择特殊的毒理学(如免疫毒理学)试验已经作为常规的检测和评价手段用于安全性评价中。目前，许多国家都已建立适合于本国的免疫毒性检测方案，这些方案的检测项目及内容还在不断的变化与更新，但仍存在不少问题。ICHS8指导原则被推荐使用，标志着20多年来关于药物免疫毒性问题的一系列国际活动取得明显进展，免疫抑制的评价在欧洲、美国和日本间达成共识，但其适用范围有限。就分级筛选机制而言，各国在一级筛选试验中是否加入免疫功能指标也存在分歧，ICHS8和OECD认为在一级筛选试验中未列入免疫功能试验，而美国EPA、NTP和CDRH以及欧洲EMEA则认为免疫功能试验的敏感性较好，在一级筛选试验中除进行免疫病理学检测外还应加入免疫功能指标。早期的免疫毒性评价方法主要关注免疫抑制，随着免疫毒理学的进一步发展，免疫刺激、自身免疫和超敏反应也被列入免疫毒理学毒理学的范畴。因此，各国在制订免疫毒性指南时逐渐考虑到了这些方面，但目前国际上就此尚未建立起较为全面的免疫毒理学评价方法。因此，全面、逐步、协调和个案处理策略仍是今后免疫毒理学安全性评价方法的主导原则。