谈填埋垃圾生物反应器反硝化特性范文

摘要:利用模拟生物反应器研究了不同填埋龄垃圾在自身降解产生的有机物量不足时的反硝化特征;并以nirS基因为分子标记，采用“PCR－克隆－测序”、建立基因文库的方法，探讨了反应器内反硝化微生物多样性特征。结果表明:回灌渗滤液C/N适宜的条件下，不同填埋龄垃圾堆体均可作为厌氧介质进行反硝化作用;各反应器内，反硝化菌种群结构相对单一，多样性偏低，其中，Thiobacillusdenitrificans和Azoarcustolulyticus是垃圾堆体中生长较稳定的种群，可能在渗滤液反硝化脱氮中发挥着重要作用。

关键词:垃圾生物反应器;反硝化性能;反硝化

微生物鉴于垃圾堆体本身是厌氧环境，且新鲜的垃圾可提供大量碳源，有研究者提出了生物反应器垃圾堆体渗滤液原位脱氮技术的概念［1－4］。该技术充分利用了垃圾填埋层这一厌氧系统碳源丰富的特征，结合外置硝化装置，最终实现硝化渗滤液的反硝化脱氮。但不同填埋龄的垃圾在填埋场经过一段时间的物理、化学、生物反应后，有机物逐渐降解，缓慢向无机化和腐殖化方向发展。而利用这些碳源不足的垃圾堆体作为介质，研究不同填埋龄垃圾反应器反硝化性能的研究目前还较少。同时，反硝化微生物因在反硝化过程中发挥着重要作用而被越来越多的人关注，目前的研究结果以及研究技术虽已在一定程度上揭示了反硝化过程的微生物学机制，但大部分是对环境样品的分析，对废水处理工艺中的反硝化脱氮机理及微生物多样性的研究还不多［5－9］。本文选择装填4a、8a、12a垃圾的反应器(R4、R8与R12)为试验对象，用蒸馏水冲洗各反应器内垃圾堆体至COD浓度基本保持稳定，通过回灌入一定C/N的渗滤液，考察不同填埋龄垃圾在自身降解产生的有机物量不足时的反硝化特征，并结合分子生物学技术探讨反应器内反硝化微生物多样性变化规律。

1材料与方法

1.1填埋垃圾生物反应器模拟装置

填埋垃圾生物反应器模拟装置高75cm，内径20cm，由有机玻璃制成。反应器顶部装有阀门，用于渗滤液回灌;另一阀门装于反应器底部，用于渗滤液的排出;在反应器不同高度设有均匀分布的3个固体取样口。具体如图1所示。本试验共制作了3个相同模拟装置，分别装填了4a、8a、12a垃圾，相应的命名为R4、R8、R12。垃圾装填前将不可降解的物质如玻璃、塑料等剔除。每个反应器垃圾装填量约为15kg，密度约为884kg/m3。

1.2试验设计

在试验正式开展前，用蒸馏水冲洗各反应器内垃圾堆体至COD浓度基本保持稳定，具体性质如表1示。调节回灌渗滤液原液的硝酸盐负荷为500mg/L，COD浓度约为4500mg/L(C/N约为9.0)。每个反应器回灌3次，按回灌顺序分别称为Test1、Test2、Test3。定期从反应器底部采集渗滤液样品，分析相关指标。整个试验结束后，采集垃圾固体样品用于微生物多样性分析。试验过程中，室温保持在(28±1)℃。1.3渗滤液样品分析渗滤液样品的监测指标主要是COD和NO3－-N。COD的测定采用重铬酸钾法;NO3－-N的测定采用分光光度法。具体的测定方法详见《水与废水监测分析方法》［10］。1.4nirS克隆文库的建立采用FastPrepDNA提取试剂盒(QBIOGENE)提取垃圾样品总DNA。反硝化微生物PCR扩增采用nirS1F，nirS6R引物对，扩增片段长度为890bp［11］。采用25μL反应体系:10×PCRBuffer2.5μL;dNTPs(各2.5mmol/L)1.0μL;MgCl2(25mmol/L)1.5μL;nirS1F(20μmol/L)0.5μL;nirS6R(20μmol/L)0.5μL;Taq酶(5U，Takara)0.3μL;DNA1.0μL;ddwater17.7μL。PCR反应条件:95℃预变性6min;95℃变性30s，60～55℃退火40s，72℃延伸1min，10个循环;95℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，25个循环;72℃延伸7min，4℃保持。阳性克隆的筛选:在37℃培养12～16h的转化平板上挑取带有插入片段的白色克隆，转到新的含Amp的LB平板上，37℃培养12～16h。然后用pMD18-T载体引物RV-M和M13－47作为PCR的引物，验证筛选的克隆其插入的片段大小是否正确。限制性酶切分析及测序:片断大小正确的nirS基因PCR产物用HhaⅠ(Takara，Japan)限制性内切酶酶切。基因文库中每个OTU选择1～2个代表菌株外送测序。将测序得到的nirS基因序列与NCBIGenBank中的核酸数据进行同源性比对。用Clustalx1.83进行序列比对，用MEGA软件选择邻接法(Neighbor-joininganalysis)构建系统发育树。Bootstrap检验进行1000次取样。nirS基因文库的多样性覆盖百分率(CoverageC)的计算公式为:C=［1－(n/N)］×100(1)其中n表示基因文库中只包含一个克隆的OTU数目;N表示基因文库的克隆总数。稀释曲线用aRarefactWin软件绘制。

2结果与讨论

2.1垃圾生物反应器反硝化性能研究

根据各反应器NO3－-N浓度的变化情况(图2)可知，3次回灌过程中，R4、R8、R12均表现出较强的反硝化性能，且反硝化性能差异不大，每个反应器均可在70h左右将500mg/L的硝酸盐还原完全。整个反硝化过程，各反应器的COD浓度均随着反应的进行而降低(图3)。R8、R12COD的消耗量基本相同，而R4的COD在反应后期趋于平缓。由此推测，当回灌入反应器的渗滤液碳源充足时，不同填埋龄的垃圾均可作为厌氧介质进行反硝化作用。

2.2垃圾生物反应器反硝化微生物研究

在回灌实验结束后，采集R4、R8、R12的垃圾固体样品，提取总DNA，以亚硝酸还原酶nirS作为分子标记建立基因文库的方法，探讨生物反应器渗滤液反硝化过程中反硝化微生物的群落组成和多样性变化情况。R4、R8、R12分别建立一个nirS基因文库，共得到具正确插入片段的克隆217个。通过限制性酶切分型后分析发现，OTUs数目较少，3个nirS基因文库中共有OTUs29个，微生物群落结构较单一，序列比对后，3个nirS基因文库中最相似序列均可归属于两大类:变形菌门(Proteobacteria)细菌和未培养微生物(表2)。经计算，R4、R8和R12的多样性覆盖率分别为98.8%、95.5%和91.3%，3个基因文库的覆盖率均较高;但三者相比较，R12的覆盖率最低，说明R12的反硝化微生物多样性略高于R4和R8。由R4、R8和R12的稀释曲线图(图4)可知，R4的稀释曲线已达到平台期，而R8和R12的稀释曲线仍处于上升趋势，尤其是R12。将获得的克隆和比对到的最相近已知物种构建系统发育树，结果如图5所示。从图2已知，R4、R8和R12在回灌渗滤液有机物充足的情况下均具有较强的反硝化性能。现从系统发育树的结果证实，各反应器内均存在着大量反硝化菌，但不同填埋龄垃圾反应器间的反硝化微生物群落结构存在一定差异。结合表3R4、R8和R12各文库中与相近物种的克隆数分布情况可知:R4nirS文库中的优势菌群为Thiobacillusdenitrificans，其克隆丰富度为54.32%;R8、R12nirS文库中的优势菌群均为Azoarcustolulyticus，其克隆丰富度分别为71.64%和56.52%。从图3COD浓度的分析发现，当渗滤液回灌进入垃圾堆体后，随着反硝化作用的进行，R4反应器的COD浓度在反应后期趋于平缓，与R8和R12相比，其COD下降幅度略低。经过对R4nirS基因文库的分析发现，可能原因是R4中反硝化菌以化能自养微生物Thiobacillusdenitrificans为主，因此，反硝化过程中消耗的有机物量相对较少。另外，在R8、R12中还检测到了脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)。近几年对该菌脱氮机理的研究较多，基本已证实Paracoccusdenitrificans无论在好氧还是厌氧环境下都可利用自己独特的酶系统进行反硝化作用［12－14］。

3结论

1)利用不同填埋龄垃圾作为反硝化作用介质，当垃圾自身降解产生的有机物量不足时，只要提供足够的碳源，所有垃圾堆体均可作为厌氧处理系统进行反硝化作用，且反硝化性能差异不大。2)对反应器内反硝化微生物种群结构的研究发现，不同填埋龄垃圾生物反应器内的最相似序列均可归属于变形菌门(Proteobacteria)细菌和未培养微生物两大类，其中，Thiobacillusdenitrificans和Azoarcustolulyticus是生长相对较稳定的种群。

作者：吴松维 吴伟祥 单位：衢州学院